Instituto de Hematología e Inmunología

Modificación de un medio de cultivo para la determinación de folatos

MsC. Mariela Forrellat Barrios,1 Dra. Norma Fernández Delgado,1 Dra. Hortensia Gautier du Défaix Gómez 1 y Lic. Daniel Benítez Zequeira 2

Resumen

Para la determinación de folatos se emplea una técnica microbiológica que requiere la utilización de medios de cultivo de difícil adquisición por ser importados. En los últimos años se confrontaron dificultades para la obtención del medio de mantenimiento líquido que obligaron a desarrollar un medio que permitiera mantener la realización de estas importantes determinaciones, que se obtuvo a partir de la modificación de un medio de cultivo comercial empleando jugo de naranja proveniente de cualquier variedad, al que nombramos CITRUFOL-IHI. Los resultados de la comparación con el medio de cultivo comercial evidenciaron la validez de la sustitución, lo que posibilita mantener las determinaciones de folatos imprescindibles como apoyo de los programas de prevención de malformaciones congénitas y para el estudio de las anemias megaloblásticas y las neuropatías. La producción del CITRUFOL-IHI puede realizarse fácilmente y en pequeñas cantidades de acuerdo con las necesidades, evitando las pérdidas por deterioro, lo que hace de este un reactivo con posibilidades de generalización.

Palabras clave: ácido fólico, medios de cultivo, deficiencia de ácido fólico.

El folato, una de las vitaminas del complejo B, se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y forma parte de suplementos vitamínicos y minerales como ácido fólico, que es la forma sintética. La deficiencia de esta vitamina, que constituye una de las principales causas de anemia nutricional, afecta a las personas que consumen dietas pobres en frutas y vegetales, y a un tercio de las embarazadas, entre las cuales constituye causa de trastornos obstétricos.

Desde los años 50 se planteó una relación directa entre la dieta y los defectos del tubo neural (DTN),1 y ya en 1964 Hibbard 2 sugirió que el ácido fólico podía estar implicado en el origen de los DTN, fundamentalmente de la espina bífida, la anencefalia y el encefalocele; también se ha asociado con riesgo de enfermedad vascular y cáncer.3 Se plantea que de cada 1 000 concepciones, 150 terminan en un aborto espontáneo, tal vez relacionado con una deficiencia de ácido fólico, y de los que alcanzan el término, aproximadamente 1 de cada 400 presenta una malformación del tubo neural. 4-6 En el mundo se reportan aproximadamente 400 000 casos de DTN por año. De acuerdo con los datos del CDC, en Estados Unidos se reportan 2 500 niños nacidos con espina bífida o anencefalia cada año, y de los que alcanzan la adultez, el 30 % presenta retraso mental severo.1 Por su parte, en España, según estudios del ECEMC, la prevalencia de estos defectos es de 8 por cada 10 000.7 En nuestro país se reporta una prevalencia ajustada al nacimiento de 1,72 x 1 000 (comunicación personal).

Se conoce que los gastos médicos y quirúrgicos provocados por estas malformaciones son superiores a 200 000 millones de dólares y que la deficiencia de folatos está relacionada además con el parto pretérmino, la toxemia gravídica y el retardo del crecimiento intrauterino. Es por ello que en la prevención de estos trastornos se recomienda, además de la suplementación periconcepcional con folatos, el estudio de marcadores bioquímicos como el folato sérico y eritrocitario.8

Para la determinación de folatos, la OMS recomienda el método microbiológico que emplea el Lactobacillus casei, en cuya realización son necesarios 3 medios de cultivo usualmente importados con las consecuentes dificultades para su adquisición, especialmente de tipo económico. Estos inconvenientes conllevaron a que en la década de los 80, se desarrollara en nuestro laboratorio el medio de cultivo de ensayo Z3.9

A finales de los años 90, con el recrudecimiento del bloqueo y sus implicaciones negativas para la compra de reactivos, nos vimos imposibilitados de obtener el medio de mantenimiento líquido necesario para continuar realizando las determinaciones de folato. Por estos motivos, desarrollamos un medio de mantenimiento líquido que nos permitiera sustituir el medio comercial importado para poder mantener la realización de estas importantes determinaciones, lo cual constituyó el objetivo de este trabajo.

Métodos

Se analizó la composición del medio de cultivo comercial, que se muestra a continuación, y se valoraron las posibles variaciones de acuerdo con los reactivos disponibles.

Composición del Lactobacilli broth AOAC, Difco (1L):

Leche peptonizada	15 g
Extracto de levadura	5 g
Dextrosa	10 g
Jugo de tomate (100 mL)	5 g
Fosfato monobásico de potasio	2 g
Tween 80	1 g

pH final 6,8 ± 0,2.

Se realizó la sustitución del jugo de tomate por jugo de frutas cítricas más frecuentes y asequibles en nuestro medio durante todo el año. Para ello se realizaron pruebas con jugo de piña, limón y naranja; este último fue el de mejores resultados y más fácil obtención.

Una vez seleccionado el jugo de frutas a utilizar, se preparó el medio modificado al que nombramos CITRUFOL-IHI y se realizaron curvas de calibración con inóculos preparados a partir del mismo, para su comparación con las obtenidas con el medio comercial. Para ello se utilizó la prueba t Student para muestras independientes a partir de una base de datos procesada por el sistema SPSS.

Finalmente se calculó el costo de los componentes para producir 1L de medio de mantenimiento CITRUFOL-IHI y el ahorro que ha significado su empleo en la sustitución del importado.

Resultados

A continuación se muestran los componentes del medio de mantenimiento líquido CITRUFOL-IHI obtenido por nosotros, que tiene como característica distintiva la utilización del jugo de naranja como fuente de folatos y agentes reductores que completan el aporte de nutrientes que se requiere para el mantenimiento del L.casei.

Composición del CITRUFOL-IHI (200mL):

Leche peptonizada	3 g
Extracto de levadura	1 g
Dextrosa	2 g
Jugo de Naranja	20 mL
Fosfato monobásico de potasio	400 mg
Tween 80	200 µL

Los reactivos se pesaron por separado y se mezclaron en el orden que se enuncian. El jugo de naranja se preparó mediante extracción del zumo de la fruta de cualquier variedad disponible, que fue filtrado 2 veces por papel de filtro Whatman, para obtener un jugo transparente y sin partículas. El pH final de la mezcla fue de 5,0 y se ajustó a 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1 mol/L.

Como se observa en la figura, las curvas de calibración obtenidas a partir de inóculos preparados con el CITRUFOL-IHI no difieren de las obtenidas utilizando el medio comercial. Esto se corroboró estadísticamente al comparar ambas curvas mediante la t Student (tabla 1), lo que nos permite plantear que el medio modificado puede utilizarse en sustitución del medio comercial.

Tabla 1. Comparación de las curvas de calibración utilizando los medios de mantenimiento comercial y CITRUFOL-IHI

Medio de mantenimiento	n	`X	DS
Comercial	189	504,74	182,16
CITRUFOL-IHI	189	492,88	195,24

p = 0,542.

Tabla 2. Ahorro en la producción de 1L de medio CITRUFOL-IHI

Medio de mantenimiento	Costo (USD)
Comercial	27,66
CITRUFOL-IHI	2, 00
Ahorro	25,66

Figura 1. Curvas de calibración utilizando los medios mantenimiento comercial y CITRUFOL-IHI.

 

 

Discusión

La exactitud de los resultados obtenidos con el CITRUFOL-IHI, independientemente de la variedad de naranja empleada, evidencia la factibilidad de su utilización en sustitución del medio comercial.

Otro aspecto a destacar es la posibilidad de su producción en pequeñas cantidades acorde con las necesidades, eliminando así la posibilidad de deterioro por almacenamiento prolongado y vencimiento del producto.

Summary

For the determination of folates it is used a microbiological technique requiring the use of culture media that are difficult to be acquired, since they are imported. During the last years, there have been difficulties to obtain the liquid maintenance medium that led to the development of a medium that allow to keep on making these important determinations. It was attained by modifying a commercial culture medium by using orange juice from any variety that was called CITRUFOL-IHI. The results of the comparison with the commercial culture medium showed the validity of the substitution, making possible to continue the determinations of folates as a support of the prevention programs of congenital malformations and for studying megasloblastic anemias and neuropathies. CITRUFOL-IHI may be easily produced in small quantities according to the needs, avoiding the losses by deterioration, and turning it into a reagent with generalization possibilities.

Key words: folic acid, culture media, folic acid deficiency.

Referencias bibliográficas

1. Control Disease Center. Economic burden of spina bifida- United States, 1980 -1990. MMWR 1989;38:264-7.
   
2. Hibbard BM. The role of folic acid in pregnancy: with particular reference to anaemia, abruption and abortion. J Obstet Gynaecol Br Commomv 1964;71: 529-42.
   
3. Bailey LB, Rampersaud GC, Kauwell GPA. Folic acid supplements and fortification affect the risk for neural tube defects, vascular disease and cancer: Evolving science. J Nutr 2003;133:1961S-8S.
   
4. De la Riva AM, Marqués Gubern A. Prevención y diagnóstico prenatal de los defectos del tubo neural. Cir Pediatr 1990;3:35-6.
   
5. Thompson SJ, Torres ME, Stevenson RE, Dean JH, Best RG. Periconceptional multivitamin folic acid use, dietary folate, total folate and risk of neural tube defects in South Carolina. Ann Epidemiol 2003;13:412-8.
   
6. Frey L, Ilauser WA. Epidemiology of neural tube defects. Epilepsia 2003; 44:4-13.
   
7. Martínez Frías ML. Defectos congénitos en España. Diez años de vigilancia epidemiológica. Estudios sanitarios. Dirección General de Planificación Sanitaria. Madrid: Ministerio de Sanidad y Consumo; 1989.
   
8. Hernández de Alba C. Guía práctica en diagnóstico prenatal. Disponible en: http://www.encolombia.com.
   
9. Vidal H, Martínez J, Gautier du Défaix H. Desarrollo de un medio de cultivo para medir ácido fólico en sangre. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1985(1):99 -106.

Recibido : 10 de diciembre del 2003. Aprobado:
MsC. Mariela Forrellat Barrios. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Tel [phone], 544214. Fax [phone]. e-mail: [e-mail]

1 Instituto de Hematología e Inmunología.
2 Facultad de Ciencias Médicas "Julio Trigo".