Instituto de Hematología e Inmunología

Aplicación del método inmunocitoquímico de la fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalina para la clasificación inmunológica de las leucemias mieloides agudas

Lic. Bertha B. Socarrás Ferrer, Lic. Lázaro O. del Valle Pérez, Dra. Vianed Marsán Súarez, Lic. Julio C. Merlín Linares y Dra. Consuelo Macías Abraham

Resumen

Se realizó el inmunofenotipaje celular de 30 pacientes con el diagnóstico de leucemia mieloide aguda por el método inmunocitoquímico fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalina (APAAP) introducido en nuestro laboratorio. Los marcadores estudiados fueron: CD3, CD13, CD15, CD19, CD33 y CD41. Para el estudio se utilizaron extendidos de médula ósea o sangre periférica fijados en acetona pura e incubados con el respectivo anticuerpo monoclonal. Posteriormente se añadió la inmunoglobulina anti ratón obtenida en conejo ( Linking ) y por último, el complejo APAAP. Los períodos de incubación fueron de 30 minutos y se realizaron lavados con solución amortiguadora entre cada uno de los pasos. La lectura de las láminas se realizó en microscopio óptico y se consideró positivo cuando el número de células marcadas era mayor o igual a 20 %. De los pacientes estudiados, el 93,3 % y el 90 %, respectivamente, expresaron antígenos pan mieloides CD13 y CD33; 16 de ellos expresaron el CD15 (53,3 %); 3 el CD19 (10 %) y 2 el CD41 (6,6 %). Se concluyó que el método APAAP es rápido y de bajo costo y puede ser aplicado con confiabilidad en la clasificación inmunológica de las leucemias mieloides agudas.

Palabras clave: leucemia mieloide aguda, método inmunocitoquímico APAAP, anticuerpos monoclonales.

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia maligna de las células hematopoyéticas caracterizada por una proliferación anormal de las células precursoras mieloides que detiene e impide la diferenciación celular y el crecimiento no controlado de células leucémicas que se originan en la médula ósea (MO), y posteriormente se diseminan a sangre periférica (SP) y al resto de los tejidos.1,2

La LMA es menos frecuente que la leucemia linfoide aguda e implica del 15 al 20 % de los pacientes con leucemia. 2 Tanto en Cuba como en el resto del mundo, la LMA es poco frecuente en las edades pediátricas y su incidencia se incrementa a partir de los 45 años de edad. La relación de frecuencia entre los sexos es ligeramente superior en el masculino. En los países industrializados, las tasas de incidencia son discretamente superiores.3-6

El diagnóstico de las hemopatías malignas como la determinación de subpoblaciones linfocitarias se puede realizar por inmunofluorescencia directa e indirecta y por métodos inmunocitoquímicos como el ultramicrométodo inmunocitoquímico (UMICIQ) y el de la fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalina (APAAP), que utilizan anticuerpos conjugados con enzimas como la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.7-10 Estas técnicas inmunoenzimáticas permiten visualizar las células con un microscopio óptico y además observar simultáneamente tanto la morfología celular como la reacción inmunológica de sus antígenos con los anticuerpos específicos.

Por tal motivo, en este trabajo nos propusimos utilizar el método APAAP introducido previamente en nuestro laboratorio para la clasificación inmunológica de las células blásticas de un grupo de pacientes con leucemia mieloide aguda.

Métodos

Se estudiaron 30 pacientes con diagnóstico de LMA, 23 del sexo masculino y 7 del femenino, con un rango de edades entre 7 y 80 años, atendidos y diagnosticados en las consultas del Instituto de Hematología e Inmunología.

Método inmunocitoquímico APAAP

Los marcadores estudiados fueron: CD3, CD13, CD15, CD19, CD33, CD41. Se utilizaron extendidos de MO o de SP fijados en acetona pura por 10 minutos, a temperatura ambiente (TA) en incubados en cámara húmeda con su respectivo anticuerpo monoclonal (AcMo) en una dilución de 1:20. Posteriormente, se añadió la inmunoglobulina anti ratón obtenida en conejo (Linking) y por último, el complejo APAAP, que consiste en complejos solubles de fosfatasa alcalina del intestino de ternero y un AcMo de ratón anti-fosfatasa alcalina. Los períodos de incubación fueron de 30 minutos y se realizaron lavados con una solución amortiguadora de tris hidroximetilaminometano 0,5 M , pH 7,6 entre cada uno de los pasos. La coloración se realizó con naftol-AX-MX- fosfato, levamisol y rojo violeta y la contracoloración con hematoxilina de Gill.9

Se realizó la lectura en un microscopio óptico Dialux 20 EB (Leitz, RFA). Se contaron al menos 100 células en cada lámina y se consideró positivo para ese marcador cuando el número de células marcadas fuera igual o mayor que el 20 %.

Se determinó el porcentaje de los marcadores de membrana estudiados y el de los distintos subtipos de LMA.

El panel de AcMo utilizados en el inmunofenotipaje celular se observa en la tabla.

Tabla. Panel de anticuerpos monoclonales (AcMo) para el inmunofenotipaje celular

CD	AcMo	Fuente
Dirigidos contra células T
CD3	OKT3	Hosp. Clín. Barcelona, Barcelona, España
Dirigidos contra células B
CD19	anti-CD19	Inst. of Cancer Research, Londres, Inglaterra
Dirigidos contra células mieloides
CD13	My7	Hosp. Clín. Barcelona, Barcelona, España
CD15	Leu21	Filatov Institute of Immunology, Rusia
CD33	My9	Institute of Cancer Research, Londres, Inglaterra
CD41	943D	Hosp. Clín. Barcelona, Barcelona, España

Resultados

De los 30 pacientes estudiados expresaron antígenos pan mieloides CD13 y CD33, el 93,3 % y el 90 %, respectivamente; 16 de ellos expresaron el CD15 para el 53,3 % y solo 3 pacientes el CD19, lo que representa el 10 % del total (fig. 1).

Fig. 1.  Porcentaje de los marcadores de membrana en pacientes con leucemia mieloide aguda.

Al analizar el comportamiento de los subtipos de LMA, se observó un predominio de las variedades M1 y M2, para el 73,3 % (22 casos). Las variedades M4, M5 y M7 constituyeron las menos frecuentemente observadas, con el 6,7 % (2 casos), el 13,3 % (4 casos) y el 6,7 % (2 casos), respectivamente (fig. 2).

Fig. 2. Porcentaje de los subtipos de LMA de leucemia mieloide aguda.

Discusión

Para un diagnóstico exacto de las leucemias agudas es necesario emplear diferentes métodos. El morfológico es el más antiguo y el más importante en la actualidad, pues destaca las 2 variedades principales de leucemia aguda: la linfoide y la mieloide. Existen además métodos citoquímicos, citogenéticos, de biología molecular y de inmunofenotipaje celular. Todos estos parámetros son importantes para la clasificación de estas enfermedades en sus diferentes subtipos, y de esta manera, el tratamiento de estas hemopatías es más específico y puede utilizarse con mayor precisión y efectividad.11-13

Por lo general, la LMA presenta fenotipos heterogéneos y la mayoría de las células leucémicas mieloides expresan los antígenos CD13 y CD33. Esto fue comprobado en nuestro estudio, donde del total de pacientes, 28 (93,3 %), expresan el CD13, y 27 de ellos (90 %) expresaron el CD33.14

En cuanto al porcentaje de los subtipos de LMA, 22 pacientes se clasificaron como M1/M2, lo que constituye el 73,3 % del total, 2 casos (6,7 %) se diagnosticaron como M4 y M7, y 4 (13,3 %) como M5, lo que coincide con lo descrito por otros investigadores.14,15

Los métodos inmunocitoquímicos APAAP y UMICIQ se aplican con éxito en el estudio de las inmunodeficiencias y en la caracterización inmunológica de las células malignas en pacientes con leucemia y otras enfermedades hematológicas.8,9,16 A diferencia de otros métodos utilizados en nuestra institución de hemopatías malignas, la técnica inmunocitoquímica APAAP permite:

a) Llegar a un diagnóstico certero y seguro en un breve tiempo (3 horas).

• La conservación de láminas a temperatura ambiente con fines docentes, investigativos y estudios retrospectivos.
• Trabajar con sangre total, con lo que se prescinde el uso del Ficoll para el aislamiento de las células mononucleares.

Summary

Application of the alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase immunocytochemical method for the immunological classification of acute myeloid leukemias

The cellular immunophenotyping of 30 patients with the diagnosis of acute myeloid leukemia was conducted by the alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase immunocytochemical method (APAAP) introduced in our laboratory. The markers studied were: CD3, CD13, CD15, CD19, CD33 y CD41. Specimens of bone marrow or peripheral blood fixed in pure acetone and incubated with the respective monoclonal antibody were used for the study. Later on, the anti-mouse immunoglobulin obtained in rabbit (Linking) was added and, finally, the APAAP complex. The incubation periods were of 30 minutes and lavages with buffer solution were carried out between one step and the other. The reading of the slides was performed on the optical microscope and it was considered positive when the number of marked cells was higher than or equal to 20 %. Of the studied patients, 93.3 % and 90 %, respectively, expressed panmyeloid antigens CD13 and CD33; 16 of them expressed the CD15 (53.3 %); 3 the CD19 (10 %); and 2 the CD41 (6.6 %). It was concluded that the APAAP method is rapid and inexpensive and that it may be reliably applied in the immunological classification of the acute myeloid leukemias.

Key words: Acute myeloid leukemia, APAAP immunocytochemical method, monoclonal antibodies

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Recibido: 20 de mayo de 2006. Aprobado: 2 de junio de 2006.