Instituto de Hematología e Inmunología

Anticuerpos naturales anti banda 3. ¿Participan en el fenómeno de vasooclusión de la drepanocitosis?

DrC. Rinaldo Villaescusa Blanco, Lic. Ada Amalia Arce Hernández, Lic. Julio César Merlín Linares, Lic. Tania Herrera Rolo y Dr. Edgardo Espinosa Martínez

Resumen

Se determinó la presencia de anticuerpos naturales anti banda 3 mediante un ensayo inmunoenzimático en microplacas acopladas con la proteína banda 3 en 14 pacientes con drepanocitosis, 4 con crisis vasooclusiva dolorosa y 10 en estado basal. Se demostró una disminución significativa (p = 0,000005) de los niveles de los anticuerpos naturales anti banda 3 en el total de los pacientes al compararlos con los controles normales, lo que puede estar relacionado con un consumo elevado de estos en el proceso de aclaramiento de eritrocitos con hemoglobina SS oxidados o senescentes. No se demostró diferencia estadística entre el grupo de pacientes en estado basal y aquellos con crisis vasooclusiva dolorosa, lo cual sugiere la posibilidad de que no haya participación de los anticuerpos naturales anti banda 3 en la modulación del fenómeno oclusivo que se produce en esta enfermedad. Se recomienda el estudio longitudinal de un número mayor de pacientes, que permita profundizar en este aspecto.

Palabras clave: anticuerpos naturales anti banda 3, crisis vasooclusiva dolorosa, drepanocitosis, proteína banda 3.

La vasooclusión en la drepanocitosis se considera una característica única entre las anemias hemolíticas y aún cuando se han logrado avances en su conocimiento, las bases de su control y prevención permanecen parcialmente desconocidas; no existe un mecanismo individual que explique este fenómeno. Recientemente, se ha establecido el papel del estrés oxidativo, la activación endotelial y la inflamación en la vasooclusión, debido en parte al desarrollo de modelos murinos transgénicos de la enfermedad.1-5

Diversas investigaciones han permitido acumular información acerca de las moléculas de adhesión, tanto en eritrocitos con hemoglobina SS (HbSS) como en el endotelio vascular, así como factores plasmáticos que participan en la vasooclusión. 6-10 En la actualidad se trabaja para establecer la posible participación de la proteína banda 3 eritrocitaria y los anticuerpos naturales anti banda 3 en el fenómeno de oclusión.

La banda 3 se refiere a una familia de intercambiadores aniónicos (AE 0-3) presentes en la membrana de todas las células y organelos celulares.11-15 Bajo ciertas condiciones, la proteína banda 3 de la membrana eritrocitaria (AE 1) se agrega en la superficie del eritrocito, lo que trae como consecuencia 2 cambios significativos: primero, estas células adquieren naturaleza adhesiva, y segundo, los agregados de banda 3 son reconocidos por anticuerpos naturales anti banda 3 como parte del mecanismo de aclaramiento de eritrocitos senescentes u oxidados.16,17

Nuestro trabajo se encaminó a la determinación de anticuerpos naturales anti banda 3 eritrocitaria, mediante un ensayo inmunoenzimático en un grupo de pacientes con drepanocitosis en estado basal y con crisis vasooclusivas dolorosas, con el objetivo de establecer la posible participación de los mismos en el fenómeno de vasooclusión que se produce en esta enfermedad.

Métodos

Se estudiaron 14 enfermos con el diagnóstico de drepanocitosis (pacientes SS), con una edad promedio de 31 años y un rango entre 22 y 46 años; 4 con crisis vasooclusivas dolorosas, sin síntomas ni signos de infección u otras complicaciones clínicas y 10 en estado basal, sin manifestaciones clínicas en los 3 meses previos a la obtención de la muestra. Ninguno de los enfermos recibió transfusiones de glóbulos rojos en los 3 meses anteriores al estudio. Se incluyeron 5 controles sanos con características similares a los de la muestra problema. Los sueros de pacientes y controles sanos se obtuvieron de muestras de sangre venosa, conservándose a –70 ºC hasta su uso.

Se determinaron los niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 mediante un ensayo inmunoenzimático empleando banda 3 unida covalentemente a placas Chemobond. 18 Los sueros se diluyeron 1:400 con buffer GPBS (10 mM NaKHPO 4, 150 mM NaCl, 0,1 % gelatina, pH 7,4). Los sueros diluidos por triplicado (150 m L/pozo) se añadieron a las placas con la banda 3 inmovilizada incubándose 90 min a 37 ºC. Los pozos se lavaron 3X con buffer GPBS conteniendo Tween 20 al 0,05 %, y se incubaron a continuación 1 h a 37 ºC con un conjugado IgG-fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MI) 1:9000 (150 m L/pozo). Los pozos se lavaron 3X con GPBS- Tween 20 al 0,05 %, 3X con PBS y 1X con agua destilada. Se añadió la solución de sustrato, p-nitrofenil fosfato (pNPP, Sigma, St. Louis, MI), 150 m L/pozo, incubándose 1 h a 37 ºC. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas PR – 521 (TecnoSUMA, Cuba).

Resultados

En la tabla 1 se observa la diferencia estadística obtenida (p =,.0000006) al comparar los niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en el total de pacientes con drepanocitosis y los controles sanos.

Tabla 1. Niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en el suero de pacientes con drepanocitosis

Pacientes SS (n = 14)	Controles sanos (n = 5)	p
0,233 ± 0,068	0,473 ± 0,040	0,0000006

 

No se demostró diferencia estadística al comparar los niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en los 2 grupos de pacientes con drepanocitosis estudiados (tabla 2).

Tabla 2. Niveles de anticuerpos anti banda 3en el suero de pacientes con drepanocitosis en estado basal y con crisis vasooclusivas dolorosas (CVOD)

Pacientes SS
Estado basal (n = 10)	CVOD (n = 4)	p
0,248 ± 0,075	0,193 ± 0,024	NS

NS: no significativo.

En la figura se muestran los valores promedio y las desviaciones estándar en los pacientes con drepanocitosis en estado basal, crisis vasooclusivas dolorosas y controles sanos.

Figura. Niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en pacientes con drepanocitosis en estado basal, en crisis vasooclusiva dolorosa (CVOD) y en controles sanos.

Discusión

En hemoglobinopatías tales como la drepanocitosis, b - talasemia y deficiencias de G6PD, existe un aumento de agregados de la proteína banda 3 eritrocitaria, al compararlos con eritrocitos controles, como resultado de la oxidación y desnaturalización posterior de la hemoglobina.19 Este fenómeno se describió por primera vez en eritrocitos normales senescentes.20 La agregación de la molécula banda 3, genera un oligómero, el cual es reconocido por anticuerpos naturales de la clase IgG, lo que contrasta con la mayoría de los anticuerpos de este tipo que son comúnmente de la clase IgM.20 Estas células a las que se une el anticuerpo, reaccionan con un componente del complemento C3b que acentúa su habilidad de ser reconocidas por el sistema fagocítico-mononuclear, y son eliminadas por los macrófagos del bazo.21-23

La participación y especificidad de anticuerpos naturales anti banda 3, así como de péptidos de banda 3 en el fenómeno de adhesión endotelial de eritrocitos infectados con el Plasmodium falciparum de la malaria, ha sido demostrado in vitro empleando c élulas de melanoma y células endoteliales obtenidas de la vena umbilical humana.24,25 En un estudio realizado en niños en áreas endémicas de malaria, se demostraron niveles elevados de anticuerpos naturales anti banda 3 en el grupo de alta infectación, no así en el de bajo nivel de infectación, lo que sugiere su participación en el aclaramiento de eritrocitos parasitados; el aumento de los anticuerpos anti banda 3 se correlacionó con la disminución de la hemoglobina. (Luginbuhl A. Complement factor D, albumin and IgG anti band 3 naturally occurring antibodies mimic serum in rosetting of malaria-infected red blood cells. Tesis para optar por el Grado de Doctor en Ciencias Naturales. Swiss Federal Institute of Technology. Zurich. Switzerland, 2006).

En nuestro trabajo se obtuvieron bajos niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en el total de pacientes estudiados al compararlos con los controles sanos, lo que pudiera estar relacionado fundamentalmente con un consumo aumentado de los mismos en lo referente al aclaramiento de eritrocitos con HbSS oxidados. Aún cuando se observa cierta tendencia a la disminución de los niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en el grupo con crisis vasooclusivas dolorosas, no se demostró diferencia estadística al compararlos con los pacientes en estado basal, lo que sugiere que no haya participación de los mismos en el fenómeno de oclusión en esta enfermedad. Resultaría importante incrementar el número de pacientes, así como el estudio longitudinal de estos, que permita profundizar en dichos aspectos.

Summary

Natural anti-band 3 antibodies. Do they take part in the phenomenon of vasoocclusion drepanocytosis?

The presence of natural anti-band 3 antibodies was determined by an immunoenzymatic assay in microplaques coupled with band 3 protein in 14 patients with drepanocytosis, 4 with painful vasoocclusive crisis and 10 in the basal state. It was proved a significant reduction (p = 0,000005) of the levels of natural anti-band 3 antibodies in all the patients on comparing them with the normal controls, which may be related to an elevated consumption of these in the clearance process of oxidized or senescent erythrocytes with hemoglobin SS. There was no statistical difference between the group of patients in the basal state and those with painful vasoocclusive crisis, which suggests that the natural anti-band 3 antibodies do not take part in the modulation of the occlusive phenomenon that is produced in this disease. The longitudinal study of a greater number of patients that allows to go deep into this apect is recommended.

Key words: natural anti-band 3 antibodies, painful vasoocclusive crisis, drepanocytosis, band 3 protein.

Referencias bibliográficas

1. Nagel RL, Fabry ME. The panoply of animal models for sickle cell anemia. Br J Haematol 2001;112:19-25.

2. Belcher JD. Critical role of endothelial cell activation in hipoxia-induced vasooclusion in transgenic sickle mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288:H2715-25.

3. Mahaseth H. Polynitroxyl albumin inhibits inflammation and vasooclusion in transgenic sickle mice. J Lab Clin Med 2005;145:204-11.

4. Kaul DK, Hebbel RP. Hypoxia/reoxygenation causes inflammatory response in transgenic sickle mice but not in normal mice. J Clin Invest 2000;106:411-20.

5. Nagel RL. The challenge of painful crisis in sickle cell disease. JAMA 2001;286:2152-3.

6. Embury SH. The contribution of endothelial cell P-selectin to the microvascular flow of mouse sickle erythrocytes in vivo. Blood 2004;104:3378-85.

7. Kaul DK. Anti-inflammatory therapy ameliorates leukocyte adhesion and microvascular flow abnormalities in transgenic sickle mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004;287:H293-H301.

8. Turhan A, Weiss LA, Mohandas N, Coller BS, Frenette PS. Primary role for adherent leukocytes in sickle cell vascular occlusion: A new paradigm. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:3047-51.

9. Setty BN, Stuart MJ. Vascular cell adhesion molecule-1 is involved in mediating hypoxia-induced sickle red blood cell adherence to endothelium: Potential role in sickle cell disease. Blood 1996;88:2311-20.

10. Harlan JM. Introduction: anti-adhesion therapy in sickle cell disease. Blood 2000;95:365-7.

11. Kay MMB, Tracey CM, Goodman JR, Cone JC, Bassel PS. Polypeptides immunologically related to erythrocyte band 3 are present in nucleated somatic cells. Proc Natl Acad Sci USA 1983;80:1631-5.

12. Garlid K, Beavis A. Evidence for a existence of an inner membrane anion channel in mitochondria. Biochim Biophys Acta 1986;853:187-204.

13. Schuster VL, Bousib SM, Jennings ML. Two types of collecting duct mitochondria-rich (intercalated) cells: Lectin and band 3 cytochemistry. Am J Physiol 1986;251:C347-C55.

14. Kellokumpu S, Neff L, Jansa-Kellokumpu S, Kopito R, Baron RA. 115 kD polypeptide immunologically related to erythrocyte band 3 is present in Golgi membranes. Science 1988;242:1308-11.

15. Ruetz S, Lindsey AE, Ward CL, Kopito RR. Functional activation of plasma membrane anion exchangers occurs in a pre-Golgi compartment. Cell Biol 1993;121:37-48.

16. Thevenin BJ, Crandall I, Ballas SK. Band 3 peptides block the adherence of sickle cells to endothelial cells in vitro. Blood 1997;90:4172-9.

17. Hornig R, Lutz HU. Band 3 protein clustering on human erythrocytes promotes binding of naturally occuring anti - band 3 and anti – spectrin antibodies. Exp Geront 2000;35:1025-44.

18. Lutz HU, Stammler P, Fischer EA. Covalent binding of detergent-solubilized membrane glycoproteins to “Chemobond" plates for ELISA. J Immunol Meth 1990;129:211-20.

19. Schluter K,, Dreuckhahn D. Co-clustering of denatured hemoglobin with band 3: Its role in binding of autoantibodies against band 3 to abnormal and aged erythrocytes. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:6137-41.

20. Lutz HU, Stringaro-Wipf G. Senescent red cell-bound IgG is attached to band 3 protein. Biomed Biochim Acta 1983;42:117-21.

21. Kay MMB, Goodman J. Immunoregulation of cellular lifespan: Physiologic autoantibodies and their peptide antigens. Cell Mol Biol 2003;49:217-43.

22. Kay MMB. Isolation of the phagocytosis inducing IgG-binding antigen on senescent somatic cells. Nature 1981;289:491-4.

23. Lutz HU, Stammler P, Fasler S. Preferential formation of C3b-IgG complexes in vitro and in vivo from nascent C3b and naturally occuring and band 3 antibodies. J Biol Chem 1993;268:17418-26.

24. Crandall I, Collins We, Gysin J, Sherman JW. Synthetic peptides based on motifs present in human band 3 protein inhibit cytoadherence/sequestration of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:4703-7.

25. Crandall I, Guthrie N, Sherman IW. Plasmodium falciparum: naturally occuring rabbit immunoglobulins recognized human band 3 motifs and malaria infected red cells. Exp Parasitol 1996;82:45-53.

Recibido: 22 de diciembre del 2006. Aprobado: 15 de enero del 2007.
DrC. Rinaldo Villaescusa Blanco. Instituto de Hematología eInmunología.Apartado Postal 8070, Ciudad de La Habana, CP 10800, Cuba. Tel [phone], Fax [phone]. e -mail: [e-mail]