ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Valoración germinativa de 20 accesiones de leguminosas almacenadas en condiciones desfavorables

Germinative evaluation of 20 legume accessions stored under unfavorable conditions

Bárbara C. Muñoz1, J. A. Sánchez1, Laura A. Montejo1, Yolanda González2 y J. Reino2 1Instituto de Ecología y Sistemática

Carretera de Varona km 31/2 Capdevila, AP 8029, CP 10800 Boyeros, Ciudad de La Habana, Cuba

E-mail: ecologí[e-mail]

2Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey", Matanzas, Cuba

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RESUMEN

Se valoró la respuesta germinativa de 20 accesiones de leguminosas procedentes de diferentes tiempos de almacenamiento, en condiciones inadecuadas de humedad y temperatura, y sometidas a tratamientos de escarificación térmica y ácida antes de la siembra, con distintas temperaturas del sustrato. Independientemente del tiempo de almacenamiento, el contenido de humedad de las semillas fue inferior al 15%. Las semillas de las accesiones con más de 12 años presentaron porcentajes de germinación inferiores al 10% para todos los tratamientos de siembra ensayados, excepto en Centrosema pubescens cv. CIAT 438, Crotalaria sp. cv. Derecha, Crotalaria spectabilis, Crotalaria brownii cv. 687, Macroptilium atropurpureum, Stylosanthes guianensis cv. CIAT 136 y Mimosa invisa. El resto de las accesiones presentaron diferentes grados de pérdida de la viabilidad. Las de mejor respuesta germinativa fueron Crotalaria sp. cv. Derecha, M. invisa e Indigofera sp., debido a que alcanzaron porcentajes de germinación final superiores al 70% para, al menos, uno de los termoperíodos de siembra ensayados.

Palabras clave: Almacenamiento de semillas, escarificación, leguminosas.

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ABSTRACT

An evaluation was made of the germinative response of 20 legume accessions from different storage times, under inadequate humidity and temperature conditions, and subject to thermal and acid scarification treatments before seeding, with different temperatures of the substratum. Independently from the storage time, the moisture content of the seeds was lower than 15%. The seeds from the accessions with more than 12 years showed germination percentages lower than 10% for all the essayed planting treatments, except in Centrosema pubescens cv. CIAT 438, Crotalaria sp. cv. Derecha, Crotalaria spectabilis, Crotalaria brownii cv. 687, Macroptilium atropurpureum, Stylosanthes guianensis cv. CIAT 136 and Mimosa invisa. The other accessions showed different degrees of viability loss. The best germinative response occurred in Crotalaria sp. cv. Derecha, M. invisa and Indigofera sp., because they reached final germination percentages higher than 70% for, at least, one of the studied seeding thermoperiods.

Key words: Seed storage, scarification, legumes

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INTRODUCCIÓN

Las semillas de las leguminosas se caracterizan por presentar, como principal mecanismo de dormancia, la impermeabilidad de sus cubiertas al agua y a los gases (Sabiiti, 1983; Serrato-Valenti et al., 1993; Amodu et al., 2000; Sarmento y Schifino-Wittmann, 2000). Este tipo de dormancia se debe a la presencia de capas de células lignificadas o suberizadas en el parénquima de empalizada, aunque otras sustancias hidrofóbicas como la cutina, la pectina, la calosa y la hemicelulosa pueden ser también responsables de la impermeabilidad (Tran y Cavanagh, 1984; Serrato-Valenti et al., 1993; Kozlowski y Pallardy, 2002). Las cubiertas duras no sólo impiden la entrada de agua al embrión, sino también restringen la difusión del oxígeno al interior de este; el mantenimiento prolongado de la anaerobiosis provoca la acumulación de ácido láctico, acetaldehído y otros productos de la fermentación que son tóxicos a las semillas (Bewley y Black, 1994; Baskin y Baskin, 1998).

Entre los métodos más ampliamente utilizados para la eliminación de este tipo de dormancia se encuentran la escarificación térmica y la química, y dentro de éstas la inmersión en agua caliente y en ácidos a diferentes intervalos y concentraciones. Diversos autores han referido las ventajas de la utilización de la escarificación con ácidos concentrados respecto a los tratamientos de inmersión en agua caliente (Sabiiti, 1983; Al Yemeni y Basahy, 1999; Pandita et al., 1999). Según Orta et al. (1988) se obtiene una germinación superior al 95% en menos de 48 h, con la utilización de ácido sulfúrico concentrado en semillas frescas de diferentes leguminosas: Dolichos (10 min.), Glycine (15 min.), Leucaena (15 min.), Macroptilium (15 min.), Stylosanthes (10 min.) y Teramnus (10 min.). Sin embargo, los tratamientos de inmersión de las semillas en agua caliente son ampliamente utilizados y se obtienen resultados similares a los de la escarificación química (Schmidt, 2000; González et al., 2005).

Otra vía utilizada para la eliminación de la dormancia exógena en las leguminosas es el almacenamiento durante un tiempo prolongado (Bass, 1984); las semillas de algunas especies después de cuatro a siete años llegan a convertirse en blandas, aunque algunas como las del género Trifolium almacenadas húmedas durante 37-40 años, sólo responden ligeramente a los tratamientos de escarificación (Nikolaeva, 1982). En otros géneros como Leucaena y Teramnus, aunque envejecen y mueren de 0-18 y de 0-10 años, respectivamente, aquellas que logran sobrevivir responden al agua a 80ºC/2 min. (González et al., 2007; González y Mendoza, 2008).

El objetivo del presente estudio fue analizar la respuesta germinativa de 20 accesiones de leguminosas procedentes de diferentes tiempos de almacenamiento, en condiciones no adecuadas de humedad y temperatura, y sometidas a escarificación térmica y ácida antes de la siembra.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal y condiciones de almacenamiento. Las semillas de leguminosas fueron suministradas por la Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey", Matanzas. El almacenamiento se realizó a una temperatura entre 5-7ºC, con una humedad relativa superior a 80%. Las accesiones de cada especie se almacenaron en frascos de cristal (con tapa metálica de rosca) y permanecieron en las condiciones antes mencionadas durante diferentes tiempos (tabla 1). El estudio de las variables seminales se realizó en el Laboratorio de Semillas del Instituto de Ecología y Sistemática (IES), perteneciente al CITMA y ubicado en Ciudad de La Habana, entre septiembre del 2001 y abril del 2002.

Contenido de humedad. A cada accesión se le determinó el contenido de humedad por el método de secado a baja temperatura constante, según las normas del ISTA (1999), mediante la pesada de 10 réplicas de 50 semillas cada una, en una balanza Sartorius con precisión de 10-4.

Pruebas de germinación. Se realizó un experimento bifactorial para conocer el efecto combinado de la alternancia de temperatura del sustrato y la aplicación de tratamiento pregerminativo de escarificación térmica y ácida, en la germinación de las 20 accesiones. Se utilizaron tres rangos de temperatura: 25-30ºC, 25-35ºC y 25-40ºC, con una alternancia de 12 h para 25ºC y 8 h para la más alta de cada termoperíodo, y una transición entre ambas de 4 h; para el factor tratamiento pregerminativo se empleó la inmersión en agua a 80ºC durante 2 min. y la escarificación en ácido sulfúrico durante 5 y 10 min., respectivamente, además de un control (sin tratamiento).

Las pruebas de germinación se realizaron en placas Petri (9 cm de diámetro), sobre papel de filtro saturado en agua destilada estéril, y las semillas se incubaron en cámaras de crecimiento (Gallenkamp INF-600, Londres). Por cada tratamiento se utilizaron cinco réplicas, de 50 semillas cada una.

En todos los ensayos de germinación se consideraron como germinadas aquellas semillas con emergencia de la radícula superior a 1 mm. Se determinó el porcentaje de germinación final. A las semillas blandas que no germinaron se les practicó la prueba de TZ (Cloruro de 2, 3, 5 Trifenil Tetrazolium) según las normas del ISTA (1999), y se cuantificó el porcentaje de semillas dormantes y muertas. Aquellas que se mantuvieron duras durante la prueba de germinación se adicionaron al porcentaje de semillas dormantes.

Procesamiento estadístico de los datos. Se calcularon los valores promedio de cada variable analizada. Se empleó un ANOVA de clasificación simple con arreglo factorial de los tratamientos (tratamiento pregerminativo por termoperíodo) para el análisis de todas las variables. Las diferencias entre las medias se determinaron mediante la prueba de Duncan (1955).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Después del almacenamiento en las condiciones descritas anteriormente, las semillas de las 20 accesiones mantuvieron contenidos de humedad inferiores al 15% (tabla 1). Roberts (1981), Nikolaeva et al. (1985) y Chin et al. (1989) informaron este valor como límite para la categoría de las semillas ortodoxas. Por otra parte, Nikolaeva et al. (1985) y Chin et al. (1989) plantearon que las semillas frescas de las leguminosas presentan entre 7 y 11% de humedad. Según estos resultados, se infiere que las semillas de las accesiones estudiadas pudieran pertenecer a la categoría de ortodoxas; sin embargo, debe tenerse en cuenta que el contenido de humedad que se informa no se corresponde con el de las semillas frescas.

Centrosema pubescens cv. CIAT 5172, Clitoria ternatea (de 1999), Crotalaria brownii cv. 687, Crotalaria sp. cv. Derecha, Mimosa invisa, Desmodium ovalifolium cv. CIAT 13089, Teramnus labialis cv. Semilla Clara, Stylosanthes guianensis cv. CIAT 136, Desmanthus virgatus e Indigofera sp. tuvieron porcentajes de humedad acordes con lo reportado para las leguminosas (tabla 1). De este grupo, M. invisa y S. guianensis presentaron los valores más bajos para esta variable, debido posiblemente a una mayor impermeabilidad de sus cubiertas seminales.

Por otra parte, Neonotonia wightii cv. Tinaroo 73, Centrosema virginianum cv. CIAT 478, Centrosema plumieri cv. PI-90, Centrosema macrocarpum cv. CIAT 5065, C. pubescens cv. PII-89, C. pubescens cv. CIAT 438 y Crotalaria spectabilis mostraron valores superiores al 12%. Este último grupo de accesiones (con excepción de C. pubescens cv. CIAT 438) permanecieron por más de 12 años en las condiciones de almacenamiento descritas. Posiblemente a ello se deba el incremento en el contenido de humedad, aunque la constitución y el grado de impermeabilidad de sus cubiertas también pudo haber influido en que presentaran un deterioro heterogéneo (Schmidt, 2000).

Según Roberts (1981), cuando las semillas son almacenadas en ambientes de alta humedad y/o temperatura se aceleran los procesos de envejecimiento seminal. El almacenamiento con variaciones en la humedad relativa ambiental es más dañino a la semilla que el realizado bajo constante humedad relativa alta (Pérez-García et al., 2007). En contraste, los incrementos en la temperatura durante un almacenamiento en frío no causan daños tan perjudiciales a la viabilidad seminal como los producidos por la humedad (Bewley y Black, 1994; Gómez-Campo, 2006a).

Gómez-Campo (2006b) planteó que es recomendable sacar las semillas ortodoxas entre 4 y 6% de humedad; además pueden ultrasecarse (a 3% de humedad) y evitar así el envejecimiento seminal sin que sufran daños (Ellis y Hong, 2006).

C. pubescens cv. CIAT 438 sólo permaneció en condiciones inadecuadas de almacenamiento durante un año. Aunque no se puede descartar la posibilidad del efecto nocivo de las variaciones de la humedad ambiental en la integridad de las cubiertas seminales en esta especie, también pudieron influir en el incremento de la humedad los problemas de manejo en la colecta y/o secado de las semillas, que permitieron una menor resistencia de las cubiertas seminales al deterioro. Igualmente no se debe descartar la influencia de las condiciones ambientales en el momento de la formación y maduración de la semilla, en el ablandamiento de las cubiertas seminales para este lote de la especie.

Este último aspecto es de destacar si se tiene en cuenta que las accesiones de C. pubescens cv. CIAT 5172 y C. pubescens cv. Baracutey presentaron contenidos de humedad de 8,9 y 11,8% con 11 y 5 años de almacenamiento, respectivamente. Según Andersson y Milberg (1998), para evaluar el grado de profundidad de la dormancia seminal en una especie es necesario tener en cuenta las posibles diferencias entre poblaciones, el año de colecta y las condiciones de la planta madre, así como el factor genético, lo cual fue informado para dos cultivares de Leucaena leucocephala en cuanto al tamaño y la permeabilidad de las semillas y sus cubiertas (González et al., 2005).

Las accesiones N. wightii cv. Tinaroo 73, C. virginianum cv. CIAT 478, C. plumieri cv. PI-90, Centrosema macrocarpum cv. CIAT 5065, C. pubescens cv. PII-89, D. ovalifolium cv. CIAT 13089 y T. labialis cv. Semilla Clara presentaron una germinación final casi nula e inferior a 10%, como promedio; las semillas muertas fueron superiores a 90% en todos los tratamientos pregerminativos ensayados, para cualquier condición de siembra, excepto en C. ternatea (de 1975) con agua a 80ºC durante 2´ (75-81%), la que presentó los mayores valores de dormancia (tabla 2). Estas relaciones entre los porcentajes de germinación final, semillas dormantes y semillas muertas indican un envejecimiento seminal en las referidas accesiones.

Las semillas que presentan dormancia por cubiertas impermeables tienden a permanecer viables por más tiempo, con relación a las especies con otros tipos de dormancia, dado que las estructuras que rodean el embrión lo aíslan del medio (Bewley y Black, 1994; Baskin y Baskin, 1998). Según McDonald (1999) la causa más frecuente del deterioro seminal se debe a la peroxidación lipídica, que inicia la generación de radicales libres. Este proceso puede ocurrir tanto por autoxidación como por oxidación enzimática. Cuando el contenido de humedad es bajo se activa la vía autoxidativa. Sin embargo, ante aumentos en el contenido de humedad se estimula la oxidación enzimática por la actividad de las enzimas hidrolíticas oxidativas, como las lipoxigenasas.

En este grupo, las cinco primeras accesiones coincidieron además con una humedad superior al 11%; mientras que en las dos últimas esta variable alcanzó valores inferiores (tabla 1). En este sentido, si la causa del envejecimiento seminal de las accesiones antes mencionadas fue el mecanismo de peroxidación lipídica, en las cinco primeras posiblemente éste pudo ocurrir a través de la oxidación enzimática, dado el incremento en humedad que presentaron dichas muestras con relación al valor estimado para las leguminosas (entre 7 y 11%). Sin embargo, los contenidos de humedad en D. ovalifolium cv. CIAT 13089 y T. labialis cv. Semilla Clara fueron de 7,6% y 8,2% después de 13 y 32 años de almacenamiento, respectivamente. Posiblemente, en estos dos casos la autoxidación lipídica pudo haber sido la causa del deterioro seminal debido al contenido de humedad en las semillas, a pesar del tiempo de almacenamiento.

Aunque la relación entre los porcentajes de germinación final, de semillas dormantes y de semillas muertas para todos los tratamientos (tabla 3) en T. labialis cv. Semilla Clara indicaron un deterioro seminal, con el termoperíodo de 25-30ºC y la aplicación de tratamientos pregerminativos se alcanzó una respuesta más favorable, debido a la discreta disminución en el porcentaje de semillas muertas y el incremento en la germinación final. Según Roberts (1981), un aumento en la temperatura de siembra puede provocar un incremento en el porcentaje de semillas muertas, determinado por un refuerzo en la respiración y, como consecuencia, el agotamiento de las reservas y la muerte de las semillas más débiles del lote. En D. ovalifolium cv. CIAT 13089 no se pudo precisar una tendencia germinativa con la variación del termoperíodo de siembra.

De las accesiones con porcentaje de germinación final casi nulo en todas las condiciones ensayadas, C. ternatea (de 1975) se destacó por presentar entre 16 y 25% de semillas dormantes con la inmersión en agua a 80ºC, para cualquiera de las temperaturas de siembra (tabla 2). En esta accesión la aplicación de escarificación ácida fue totalmente inadecuada, al provocar la muerte de todas las semillas del lote. Este mecanismo ha sido descrito por Roberts (1981), Bewley y Black (1994) y Baskin y Baskin (1998), debido a un incremento en la respiración producido por la entrada abrupta de agua al interior de las simientes. Los resultados con la inmersión en agua a 80ºC inducen a creer que una parte de las semillas del lote, después de 26 años de almacenamiento, permanecieron viables con cierto grado de dormancia, que no fue posible detectar al realizar la prueba de TZ en el control.

El resto de las accesiones presentaron valores más elevados de germinación final, como promedio (tablas 3 y 4). En estos casos, el tratamiento pregerminativo aplicado en el momento de la siembra tuvo un efecto significativo en los porcentajes de semillas germinadas, dormantes y muertas en todas las accesiones; no así la temperatura de siembra y la interacción de ambos (tabla 3).

De este grupo de accesiones se destacaron, con un mayor deterioro seminal, C. pubescens cv. CIAT 438, C. spectabilis y Macroptilium atropurpureum, donde en todos los casos el contenido de humedad fue superior a 10%, la germinación final no sobrepasó el 40%, el porcentaje de semillas dormantes fue prácticamente nulo y las semillas muertas presentaron valores superiores al 60%, para cualquier termoperíodo de siembra. En este sentido, las de mayor vigor germinativo fueron Crotalaria sp., cv. Derecha, M. invisa e Indigofera sp., que alcanzaron una germinación final superior al 70% para al menos uno de los termoperíodos de siembra; se destacaron las dos últimas accesiones, con una germinación superior al 85% para el más exitoso de los tratamientos pregerminativos aplicados y con contenidos de humedad de 6,5% y 9,3%, respectivamente (tabla 1).

C. pubescens cv. Baracutey, con la escarificación ácida y siembra a 25-30ºC, alcanzó una germinación final superior a 72% (tabla 4). Sin embargo, el tratamiento de inmersión en agua caliente resultó el menos ventajoso para cualquiera de los termoperíodos de siembra, debido principalmente al incremento en el porcentaje de semillas muertas. Este resultado alerta sobre un posible deterioro seminal en este lote; así, el contenido de humedad (11,9%) parece estar dado por cierto grado de envejecimiento y no por el valor que dicha variable pudiera tener en el caso de tratarse de semillas frescas.

Como mejor tratamiento pregerminativo se recomienda la inmersión en agua a 80ºC durante 2 min., para Crotalaria sp. cv. Derecha y M. invisa; esta última también respondió favorablemente a la escarificación durante 5 min. en ácido sulfúrico concentrado. Para C. pubescens cv. CIAT 438, M. atropurpureum y S. guianensis cv. CIAT 136 la escarificación durante 5 min. en ácido sulfúrico concentrado fue la más apropiada, aunque para M. atropurpureum la inmersión en agua a 80ºC durante 2 min. también fue efectiva.

Se ha reportado dormancia en Stylosanthes scabra (Serrato-Valenti et al., 1993) por impermeabilidad de sus cubiertas al agua, producida por la presencia de sustancias fenólicas, calosa y lípidos hidrofóbicos en las células en empalizada de la testa; este tipo de dormancia se relaciona con una mayor longevidad de la semilla (Baskin y Baskin, 1998). Dados estos criterios, se infiere que las semillas de S. guianensis presentaron este tipo de dormancia, debido a que durante los 26 años de almacenamiento el contenido de humedad se mantuvo en 6,0%, y se obtuvo un mayor incremento en el porcentaje de germinación final con la escarificación ácida que con la inmersión en agua a 80ºC.

Indigofera sp. y D. virgatus, con la escarificación durante 10 min. en ácido sulfúrico concentrado, mostraron los mejores resultados para cualquier termoperíodo de siembra. En Indigofera sp. se alcanzó el 100% de germinación con 25-35ºC; mientras que para las accesiones C. pubescens cv. CIAT 5172, C. pubescens cv. Baracutey, C. ternatea (de 1999), C. spectabilis y C. brownii cv. 687 el tratamiento más eficaz varió según el termoperíodo de siembra.

En C. ternatea (de 1999) el deterioro seminal no fue tan evidente como en la accesión del año 1975 (tabla 2), ya que se obtuvieron porcentajes de germinación más elevados. En el control se observó un incremento del porcentaje de semillas dormantes al incrementarse el termoperíodo de siembra. En la accesión de 1999 (tabla 4) los tratamientos de escarificación ácida resultaron más efectivos que el de inmersión en agua a 80ºC. La escarificación química en ácido sulfúrico concentrado durante 5 min. provocó un incremento del porcentaje de germinación y una disminución de las semillas muertas, al aumentar el termoperíodo, con relación al control.

Se concluye que las semillas de las accesiones con más de 12 años de almacenamiento inadecuado tuvieron porcentajes de germinación inferiores a 10% para cualquiera de los tratamientos, excepto en C. pubescens cv. CIAT 438, C. sp. cv. Derecha, C. spectabilis, C. brownii cv. 687, M. atropurpureum, S. guianensis cv. CIAT 136 y M. invisa. El resto de las accesiones presentaron diferentes grados de pérdida de la viabilidad. Las de mayor respuesta germinativa fueron Crotalaria sp. cv. Derecha, M. invisa e Indigofera sp., con una germinación final superior al 70% para al menos uno de los termoperíodos de siembra.

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Recibido el 20 de octubre del 2008

Aceptado el 15 de mayo del 2009