Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

Técnica analítica para el estudio de estabilidad del Cromoglicato de Sodio (Cápsulas para inhalación)

Liana Liz Pérez Suárez,¹ Alfredo Fernández Serret² y Esther Alonso Jiménez³

Resumen

Se desarrolló un método analítico por cromatografía líquida de alta eficiencia para la determinación del contenido de cromoglicato de sodio en las cápsulas. La técnica desarrollada resultó ser lineal, precisa, exacta y específica, la cual fue aplicada para realizar el estudio de estabilidad acelerada y el de vida de estante. Se comprobó la estabilidad química del medicamento por un período de 2 años.

DeCs: ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS/métodos; CROMOLIN SODICO/farmacocinética; CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION/métodos; CALIDAD DE LOS MEDICAMENTOS; QUIMICA FARMACEUTICA; CAPSULAS/análisis.

El cromoglicato de sodio es el principio activo obtenido a partir de sucesivas modificaciones estructurales de una benzopirona de origen vegetal extraída de la planta Khe-llin (Ammi Viznaga). Este compuesto no se absorbe en el tracto gastrointestinal, por lo que se administra mediante inhalación durante el tratamiento profiláctico del asma bronquial. Por ello, se comercializa en forma de aerosoles y cápsulas para inhalaciones; estas últimas son seleccionadas para elaborar dicho medicamento en dosis de 22,5 mg.^1-3 La Farmacopea de los Estados Unidos (USP), edición 23, reporta la técnica oficial para el control de calidad de las cápsulas de cromoglicato de sodio por espectro-fotometría ultravioleta y se hallaron reportes sobre su detección en orina humana por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE), con el empleo de columnas de intercambio iónico y como fase móvil el uso de buffer de clorhidrato de glicina 1 mol/L a pH 3,5.^4,5

Los métodos espectrofotométricos tienen el inconveniente de la falta de especificidad debido a la interferencia posible de los productos de degradación, que pueden presentar en ocasiones un espectro idéntico al componente sin degradar y a su vez como su concentración es muy pequeña queda por debajo del límite de detección del método. En la actualidad, el indiscutible desarrollo de la cromatografía aporta al analista una herramienta no solo de alta sensibilidad y exactitud, sino que es en esencia un método separativo, que le permite medir con una gran especificidad el compuesto deseado siempre que se encuentre en el sistema de separación adecuado.⁶

Para los estudios de estabilidad un punto de capital importancia es el método analítico que se emplee, el cual debe tener como requisito fundamental la especificidad, ya que debe ser lo suficientemente selectivo para ser capaz de medir el compuesto de elección en el proceso cinético, teniendo en cuenta además los parámetros de precisión, exactitud y linealidad.⁴

El presente trabajo tuvo como objetivo el desarrollo de un método analítico que cumpliera con los requisitos fundamentales de validación para su empleo en el estudio de estabilidad del medicamento.

Métodos

Todos los reactivos empleados fueron de calidad analítica. Se empleó como sustancia de referencia cromoglicato de sodio preparado en el Departamento de Patrones del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamento (CIDEM) y para el desarrollo de la formulación, cromoglicato de sodio (materia prima) del fabricante CHEMO S.A. de Suiza, con la calidad de micronizado de partículas según las exigencias.

Las muestras analizadas para el desarrollo de este trabajo fueron identifi-cadas según los ensayos 3002, 3003 y 3004, fabricadas en el Departamento de Formas Terminadas de los Laboratorios del CIDEM y envasadas en frascos de vidrio con tapa de polipropileno.

El control de calidad se efectuó con la técnica analítica descrita en la monografía según la USP 23.

Método analítico. Para la preparación de la fase móvil se mezcló 900 mL de solución de dihidrógeno fosfato de potasio 0,05 mol/L con 200 mL de metanol. Se ajustó el pH de la solución a 7,4 ± 0,1. La detección se efectuó a 238 nm y se empleó una columna LiChrosorb RP-18 de 5 µm y 100 x 4 mm con un flujo de 1,2 mL/min. Para el registro de los cromatogramas se utilizó un procesador de datos Shimadzu CR6A.

En la preparación de la solución de referencia, se pesó el equivalente a 22,5 mg de muestra de referencia y se transfirió a un matraz aforado de 100 mL. Se disolvió y se llevó a volumen con agua destilada. Posteriormente, se tomó una alícuota de 5 mL, se trasvasó a un matraz aforado de 100 mL y se llevó a volumen con fase móvil. Para la preparación de la solución de ensayo se colocaron 5 cápsulas en un matraz aforado de 500 mL, se añadió aproximadamente 250 mL de agua destilada, se agitó en baño de agua termostatado a 37 ± 1 °C durante 20 min hasta lograr la disolución. Se enfrió y se llevó a volumen con agua destilada. Se filtró la solución anterior y se tomó una alícuota de 5 mL, la que se trasvasó a un matraz aforado de 100 mL y se llevó a volumen con fase móvil. Seguidamente se inyectaron ambas soluciones en el cromatógrafo y se realizó la cuantificación mediante el método del patrón externo.

Validación del método analítico. El estudio de la linealidad de la respuesta del detector (linealidad del sistema) se realizó mediante la preparación de una curva de calibración en un rango de concentración desde 4,5 hasta 30,0 µg/mL.

Para el cálculo de la precisión del método, se estudió la repetibilidad sobre la base de 6 determinaciones y para comprobar la reproducibilidad, se efectuaron valora-ciones por 2 analistas en 2 d diferentes.

El estudio de exactitud se realizó por el método de recuperación, mediante la preparación de muestras con diferentes niveles de cromoglicato de sodio que representan el 40, 60, 80, 100 y 120 % de la concentración teórica del principio activo en la cápsula, según la formulación propuesta. Simultáneamente se analizó la linealidad del método.

Con el objetivo de evaluar la especifi-cidad del método cromatográfico se sometió la muestra a hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina y oxidación con peróxido de hidrógeno a temperatura de 80 °C. Además, se estudió la posible interferencia de los componentes de la cápsula en el análisis cromatográfico.

Todo el estudio de validación se efectuó con muestras del lote 3003.

Estudio de estabilidad. El estudio de estabilidad se realizó por los métodos de estabilidad acelerada y vida de estante. Para realizar la valoración periódica de las muestras sometidas a condiciones acele-radas, las cápsulas del ensayo 3003 se distribuyeron y almacenaron en hornos a 40, 50, 60 y 70 ° C. Las muestras de los 3 lotes en estudio fueron almacenadas a temperatura ambiente y protegidas de la humedad y la luz, las que se valoraron al inicio y transcurridos 12 y 24 meses de fabricadas.

También se realizó el estudio de la humedad absorbida por las cápsulas del ensayo 3003, las que se colocaron en hidrostatos con humedades controladas de 84, 92 y 98 % y se valoraron a los 32 d.

Resultados

En la tabla 1 se reportan los resultados analíticos de control de calidad de los lotes estudiados.

La curva de calibración a 238 nm resultó ser lineal en el rango de con-centraciones comprendido entre 4,5 y 30,0 µg/mL. La ecuación de la recta se expresó según y = 4 168,76 x - 271,195.

El coeficiente de correlación lineal fue de 0,99991. Al aplicar la prueba de significación del intercepto, la t calculada fue menor que la t tabulada (0,82 < 2,57).

En la prueba de repetibilidad el CV fue 0,32 % y en el estudio de la reproducibilidad realizado por 2 analistas para el 95 % de probabilidad, el valor hallado en la prueba de Fisher fue menor que el tabulado (5,28 < 19,0). Para la prueba de la t de Student, el valor calculado resultó ser menor que el tabulado para 4 g.l., con el 95 % de probabilidad (1,56 < 2,78).

Los resultados del estudio de la exactitud mostraron un recobrado promedio del 98,8 % y un CV de 0,67 %, donde la pendiente de la curva de recuperación (y = 0,9939 x + 0,1012) indicó un valor de 0,9939. Al aplicar la prueba de significación de la pendiente, la t calculada fue menor que la tabulada (1,37 < 3,18). El intercepto del gráfico fue evaluado y la prueba de significación mostró que la t calculada fue menor que la tabulada (0,73 < 2,78).

Los cromatogramas obtenidos correspondientes al análisis de la especificidad se presentan en las figuras 1 y 2.

Los resultados de las valoraciones periódicas de las muestras sometidas al estudio de estabilidad acelerada se reportan en la tabla 2. A su vez la tabla 3 presenta también los resultados obtenidos del estudio de estabilidad por vida de estante.

Tabla 1. Resultados analíticos del control de calidad de los lotes estudiados

 

Ensayo	Lote 3002	Lote 3003	Lote 3004	Límites
Características organolépticas	Responde	Responde	Responde	Cápsulas duras de gelatina rojas y negras, con polvo blanco en su interior
Identificación	A. Responde	A. Responde	A. Responde	A. El espectro UV de la muestra y la referencia coinciden
	B. Responde	B. Responde	B. responde	B. Precipitado rojo
Uniformidad de dosis^*				3002- 93,1-125,9 %
	Xmedia = 109,5 %	Xmedia = 113,4 %	Xmedia = 105,4%	3003- 93,5-126,5 %
				3004- 89,6-121,2 %
	DSR = 1,8 %	DSR = 0,9 %	DSR = 1,4 %	DSR £ 6,0 %
Valoración	UV 105,6 %	112,2 %	105,5 %	95,0-125,0 %

* Intervalo ajustado para límite de aceptación asimétrico.

Tabla 2. Resultados de la valoración periódica del ensayo 3003 sometido a diferentes temperaturas

 

Temperatura
Tiempo (días)	40 °C	50 °C	60 °C	70 °C
0	113,0	113,0	113,0	113,0
3	113,9	114,2	116,1	115,8
7	115,5	113,5	112,4	113,7
25	113,7	113,6	117,9	114,4
104	115,1	114,2	114,5	113,7
119	115,9	113,1	112,9	111,5
175	109,7	111,1	110,7	107,0

Datos de concentración en %

Fig. 1. Cromatogramas de las soluciones de cromoglicato de sodio sometidas a hidrólisis ácida (B); hidrólisis básica (C); peróxido de hidrógeno (D) y la solución de referencia (A)

Fig. 2. Cromatogramas de muestras preparadas según: cápsula vacía (A); contenido de la cápsula (B) y cápsula íntegra (C).

El estudio de humedad controlada para las muestras del lote 3003 a 84, 92 y 98 % de humedad mostró valores de 116,5; 115,7 y 115,8 % respectivamente; además se observó el incremento en peso característico y el reblandecimiento de las cápsulas.

Discusión

Los resultados de las pruebas de control nos indican que cumplen con los requisitos de calidad establecidos para este producto, reportados en la monografía de la USP 23.

Tabla 3. Resultados analíticos del estudio de estabilidad por vida de estante

 

Ensayo	3002	3003	3004	Límites
Características organolépticas	Responde	Responde	Responde	Cápsulas duras de gelatina rojas y negras, con polvo blanco en su interior
Valoración inicial (HPLC)	107,6 %	113,0 %	102,1 %	95,0-125,0 %
Valoración 12 meses (HPLC)	105,0 %	115,8 %	104,3 %	95,0-125,0 %
Valoración 24 meses (HPLC)	104,6 %	115,2 %	102,8 %	95,0-125,0 %

 

Se demostró el cumplimiento de la linealidad de la respuesta del detector en el rango de concentraciones estudiado, por el alto valor de coeficiente de correlación alcanzado, así como la no significación del intercepto de la curva.

El estudio de la repetibilidad del método fue positivo, ya que el coeficiente de variabilidad es menor que el 2 %, límite máximo que se permite para métodos cromatográficos. Los valores de reproducibilidad indican que no existe diferencia significativa entre las precisiones y las medias alcanzadas por los 2 analistas. Todo esto nos permite concluir que el método propuesto ofrece una precisión adecuada.

La curva de recuperación mostró un comportamiento lineal debido al valor del coeficiente de correlación cercano a la unidad. Las pruebas estadísticas aplicadas a la pendiente y al intercepto aseguran la exactitud y linealidad del método, pues el valor de la pendiente no difiere significativamente del valor unitario y el valor del intercepto no difiere significativamente de cero.

Se comprobó que el principio activo sufre degradación en medio básico y frente al peróxido de hidrógeno; en este caso no se observó una señal aguda en 0,582 min debido probablemente a un producto de degradación. En medio ácido no se detectó descomposición del principio activo. No se observó la interferencia de los productos de degradación, ya que no se registraron picos en la zona de elución perteneciente al cromoglicato de sodio (fig. 1).

De la figura 2 se concluye que no hay influencia de los componentes de la cápsula debido a que no se detecta señal en la zona de elución del fármaco al inyectar la muestra que contiene la cápsula vacía.

Todo este estudio nos permite asegurar que el método analítico desarrollado por CLAE para el estudio de estabilidad resultó lineal, preciso, exacto y específico.

El producto presentó una gran estabilidad, ya que después de transcurridos 175 d mantuvo el contenido de principio activo conforme a los límites establecidos (tabla 2). Dado este comportamiento no fue posible el empleo de la ecuación de Ahrrenius, ya que el nivel de degradación no alcanzó un valor entre el 50 ó 60 %.

Los resultados de las valoraciones se mantienen durante el período evaluado, sin presentar cambios en el aspecto organo-léptico, lo cual indica la estabilidad de la formulación (tabla 3).

Los resultados de la valoración de las muestras sometidas al estudio de humedad controlada prueban que el tratamiento no alteró el contenido de principio activo en las cápsulas; pero el incremento en peso observado y el reblandecimiento de las cápsulas nos indica la necesidad de protegerlas de la humedad.

Se proponen 2 a como fecha de venci-miento a temperatura ambiente para el me-dicamento, protegido de la humedad y la luz.

Summary

An analytical method was developed by high pressure liquid chromatography to determine the content of sodium cromoglicate in capsules. The technique developed proved to be linear, precise, accurate and specific and it was used to conduct the study of accelerated stability and that of shelf life. The chemical stability of the drug was verified for a period of 2 years.

Subject headings: DRUG STABILITY/methods; CROMOLYN SODIUM/pharmacokinetics; CHROMATOGRAPHY, HIGH PRESSURE LIQUID/methods; DRUG QUALITY; CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL; CAPSULES/analysis.

Referencias bibliográficas

1. Goodman LS, Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. 7 ed. Buenos Aires: Editora Médica Panamericana,1988:587.
2. Morris MM. Bronchoconstriction simulated by hyperventilation of cold dry air: magnitude and duration of inhibitory effect of three doses of Sodium Cromoglicate. Allergic Clin Immunol 1985;75:153.
3. Martindale. The Extra Farmacopoeia. 29 ed. London: Pharmaceutical Press, 1989:1420.
4. United States Farmacopoeia 23 and National Formulary 18. United States Convention. Rockville: Mack Printing, 1995:431-2, 1982-4.
5. Clarke´s Isolation and identification of Drugs. 2 ed. London: Pharmaceutical Press, 1986:970.
6. Connors KA. Curso de análisis farmacéutico. Barcelona: Editorial Revert, 1981:195, 245, 443-5.

Recibido: 23 de septiembre del 2000. Aprobado: 27 de octubre del 2000.
Lic. Liliana Liz Pérez Suárez. Hospital Clinicoquirúrgico Docente "Dr. Salvador Allende". Calzada del Cerro No. 1551, Cerro, Ciudad de La Habana, Cuba.

¹ Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Hospital Clinicoquirúrgico Docente "Dr. Salvador Allende".
² Master en Ciencias. Licenciado en Química. Investigador Auxiliar.
³ Técnica en Tecnología Farmacéutica.