Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto"

Método citoquímico para evaluar adherencia en leucocitos polimorfonucleares neutrófilos

Lic. Tatiana Vázquez González,1 Lic. José de la Paz Naranjo,2 Lic. Adriana Sin Mayor,3 Dra. Edelis Castellanos Puerto4 y Téc. Ana Rojas Moya5

Resumen

Se desarrolló un método citoquímico cuantitativo y sencillo para evaluar adherencia en leucocitos polimorfonucleares neutrófilos. Las células fueron aisladas por gradiente de densidad a partir de sangre periférica de 47 donantes voluntarios que acudieron al Servicio de Transfusiones del Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto”. La cualidad adhesiva se amplificó mediante la determinación de proteínas totales por el método de Lowry, luego de incubar los fagocitos en placas plásticas de cultivo de 24 pozos. El mayor número de valores se encontró entre 6 y 10 mg/dL, lo que representó el 70 % de los sujetos evaluados. La combinación de la placa de cultivo como superficie de adhesión y la determinación de proteínas como forma de amplificar esta cualidad, constituye una novedad del método propuesto.

DeCS: ADHERENCIA CELULAR; TEST DE INHIBICION DE ADHERENCIA LEUCOCITICA/métodos; TRANSFUSION SANGUINEA; FAGOCITOSIS; HISTOCITOQUIMICA.

El ser humano está expuesto a disímiles microorganismos patógenos, cuya invasión y colonización originan múltiples enfermedades, aunque no siempre logran este acometido gracias a la acción del sistema inmunológico.

Entre estos mecanismos efectores o de respuesta inespecíficos se encuentra la fagocitosis, la cual consiste en el reconocimiento, englobamiento, ingestión y destrucción del agente extraño, por células especializadas llamadas fagocitos.

La adherencia de estos fagocitos a través de las moléculas de adhesión expresadas en su superficie, al endotelio vascular, después de una señal quimiotáxica constituye el primer evento de este proceso fagocítico. Por lo que cualquier alteración de esta etapa repercute negativamente en la fagocitosis en general.1-4

Es por lo antes planteado que resulta de interés la evaluación de la adherencia en leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN) de pacientes con trastornos en el mecanismo fagocítico en particular e inmunodeficiencias celulares en general para un diagnóstico más preciso, y de gran utilidad cualquier método que permita alcanzar este objetivo.

Métodos

Muestra. A 47 donantes voluntarios de sangre, que acudieron al Servicio de Transfusiones del Instituto Superior de Medicina Militar “ Dr. Luis Díaz Soto” y que cumplían los criterios de inclusión siguientes: edad entre 16 y 40 años y no haber recibido tratamiento con fármacos inmunomoduladores, hemoterapia o ambos, en los últimos 6 meses, se les tomó muestras de sangre venosa y se depositó en tubos de ensayo plásticos que contenían heparina libre de preservo (50 UI/mL).

Aislamiento de polimorfonucleares neutrófilos. Sangre anticoagulada y diluida con solución salina fisiológica (SSF) volumen a volumen, se depositó sobre un gradiente Ficoll-Telebrix densidad (1,077 g/cm3), y se centrifugó a 1 500 r.p.m. durante 30 min. Los PMN así aislados se lavaron con SSF y se centrifugaron a 1 500 r.p.m. durante 5 min. Posteriormente se sometieron a 2 shocks osmóticos sucesivos con solución de cloruro de amonio (SCA), para eliminar los eritrocitos contaminantes. La SCA entonces fue eliminada por 2 nuevos lavados con SSF y los PMN ajustados a la concentración de 4 x 106 cel/mL de medio esencial mínimo. La viabilidad celular fue determinada por la técnica de exclusión con Tripan azul.5

Ensayo de adherencia celular. Para el ensayo fueron empleadas placas plásticas de cultivo de 24 pozos con fondo plano. Se depositó 0,5 mL de la suspensión celular en cada pozo e inmediatamente esta se incubó a 37 °C, en atmósfera de humedad durante 30 min. Un control negativo (testigo sin células) fue también incluido en el ensayo. Las células no adheridas, finalizado el tiempo de incubación, se eliminaron por lavados con SSF. Finalmente se adicionó a cada pozo 0,25 mL de agua destilada fría, se agitó vigorosamente para lograr el lisado de los PMN adheridos y se dejó reposar durante 15 min a temperatura ambiente. El contenido de 2 pozos por muestra se utilizó para la cuantificación de proteínas. El método empleado fue el de Lowry, las determinaciones realizadas por duplicado y las concentraciones informadas en miligramo por decilitro.6

Curva de calibración. Fue obtenida por ploteo de 5 concentraciones diferentes de una solución de albúmina de suero bovino (Merck) y calculada la ecuación de la recta por el método de los mínimos cuadrados, a partir de un triplicado de la curva. Esta última se utilizó para el cálculo, por interpolación, de las concentraciones proteicas de las muestras ensayadas.

Análisis estadístico. Los datos obtenidos se procesaron de forma automatizada a través del paquete estadístico STADISTICA. El nivel de significación se fijó en una p £ 0,05.

Resultados

Se encontraron concentraciones de proteínas entre 2 y 16 mg/dL, con un pico máximo del recorrido de la variable en 8 mg/dL. Al realizar la prueba de Shapiro Wilk se encontró que esta variable cumple con una distribución normal, con un nivel de confiabilidad estadística del 95 %.

La curva de calibración obtenida fue lineal en el recorrido de valores ploteados y el coeficiente de correlación (r) de 0,997. Además se encontró una relación coeficiente de variación en condiciones de rutina/coeficiente de variación en condiciones óptimas menor que 2. Valores estos de calidad aceptados metodológicamente para ensayos fotométricos.7

Discusión

En ensayos realizados in vitro se ha informado que los PMN de individuos con deficiencias en la adhesión tienden a mostrar pérdida de la habilidad para adherirse a la superficie del plástico. Esto se relaciona in vivo con una disminución de la capacidad de los fagocitos para difundir a la zona del daño, formar seudópodos y por consiguiente fagocitar las partículas extrañas. Además la literatura informa una correlación directa entre los ensayos automatizados que miden cantidad de células con los que determinan la concentración proteica, aspectos estos tenidos también en cuenta para desarrollar este proceder.8-11

Basados en estos hallazgos se empleó la placa de cultivo plástica de 24 pozos como superficie de adhesión y se combinó, para la amplificación de esta cualidad celular, con la determinación de proteínas, que aunque ya informados por otros autores no habían sido antes tenidas en cuenta en el mismo ensayo, lo que constituye una novedad introducida en el método.

En general se puede concluir que el método propuesto aparece fundamentado en la literatura científica, es ventajoso con propósitos diagnóstico y de seguimiento de la evolución, y no requiere de equipos ni reactivos especiales.

Summary

A simple cytochemical and quantitative method was developed to evaluate the adherence in polymorphonucelar neutrophil leucocytes. The cells were isolated by density gradient from peripheral blood of 47 volunteer donors that went to the Transfusions Service of “Dr. Luis Díaz Soto” Higher Institute of Military Medicine. The adhesive quality was amplified by the determination of total proteins by the method of Lowry, after incubating the phagocytes in plastic culture plates of 24 pits. The highest number of values was found between 6 and 10 mg/dL, which accounted for 70 % of the evaluated subjects. The combination of the culture plate as adhesion surface and the determination of proteins as a way to amplify this quality, is a novelty of the proposed method.

Subject headings: CELL ADHESION; LEUCOCYTE ADHERENCE INHIBITION TEST/methods; BLOOD TRANSFUSION; PHAGOCYTOSIS; HYSTOCYTOCHEMISTRY.

Referencias bibliográficas

1. Allen LAH, Aderem A. Mechanisms of phagocytosis. Cur Opin Immunol 1996;8:36-40.
2. Etzioni A. Adhesion molecule deficiencies and their clinical significance. Cell Adhes Common 1994;2:257-60.
3. Gresham HD, Graham IL, Anderson DC, Brown EJ. Leukocyte adhesion deficient (LAD) neutrophils fail to amplify phagocytic function in response to stimulation: evidence for CD 11b/CD18 -dependent and -independent mechanisms of phagocytosis. J Clin Invest 1991;88:588-97.
4. Brown EJ, Lindberg FP. Leukocyte adhesion molecules in host defense against infection. Ann Med 1996;28:201-8.
5. Ruth BB, Forrester FT. Basic Laboratory Techniques in Cell Culture. Atlanta: Public Health Service; 1981:125.
6. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Química clínica. Bases y técnicas. Barcelona: Editorial Jims; 1980:325.
7. Pascual CM, Torres WY. Control de calidad en bioquímica clínica. La Habana: Editorial Ciencias Médicas; 1989:44.
8. Etzioni A. Adhesion molecule deficiencies and their clinical significance. Cell Adhes Cummun 1994;2:257-60.
9. Stepniewicz W, Tchorzewski H, Luciak M. Factors influencing human leukocyte adherence in vitro. Folia Haematol Int Mag Klin Morphol Blutforsch 1983;110(3):373-9.
10. Santini GF, Battisti S, De Paoli P, Villalta D, Borean M, Basaglia G. A method for the determination of the adherence of granuocytes to microtitre plates. J Imunol Methods 1987;100(1-2):153-6.
11. Abal AM, Fekete B. A simple methods to evaluate leukocyte adherence and adherence inhibition in tubes. Acta Med Acad Sci Hung 1982;39(3-4):155-60.

Recibido: 29 de agosto del 2000. Aprobado: 13 de septiembre del 2000.
Lic. Tatiana Vázquez González. Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto”. Avenida Monumental, Habana del Este, CP 11700, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Licenciada en Bioquímica. Aspirante a Investigadora.
2 Licenciado en Bioquímica. Investigador Agregado.
3 Licenciada en Biología. Aspirante a Investigadora.
4 Especialista del I Grado en Inmunología Básica y Clínica.
5 Técnica en Investigaciones Bioquímicas.