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Revista Cubana de Medicina Tropical

Print version ISSN 0375-0760On-line version ISSN 1561-3054

Rev Cubana Med Trop vol.55 no.1 Ciudad de la Habana Jan.-Apr. 2003

 

Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

Detección de respuesta linfoproliferativa en monos inoculados con virus dengue 4

Lic. Gissel García,1 Lic. Mailing Álvarez,2 Lic. Elaine Santana,3 Dr. José Rafael Martínez,4 Dr. Alejandro Álvarez,5 Lic. Rosmary Rodríguez6 y Dra. María G. Guzmán7

Resumen

Se inmunizó con virus dengue 4 (cepa estándar H247), un grupo de 6 monos Cynomolgus y, 60 d después de la inoculación, se midió la proliferación celular frente al mismo serotipo, así como frente a los serotipos heterólogos 1 y 2. Se detectó una respuesta proliferativa predominantemente serotipo específica y alguna reactividad cruzada. Estos resultados evidencian un comportamiento de los primates en alguna medida similar al de humanos y ratones, en la respuesta serotipo específica y serotipo cruzada al virus dengue.

DeCS: VIRUS DEL DENGUE/inmunologia; DENGUE/inmunologia; MACACA FASCICULARIS; MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD; LINFOCITOS T/inmunología.

 

Los progresos para entender la inmunopatogénesis del dengue han sido lentos por la ausencia de un modelo animal que la reproduzca. El estudio de la respuesta inmune a virus dengue se ha llevado a cabo en humanos y ratones. Así, por ejemplo, se ha estudiado en ambas especies la respuesta de linfocitos T CD4+ y CD8+; se encontró que esta en ratones, es cualitativamente similar a la que tiene lugar en los humanos, caracterizándose por una fuerte respuesta específica y respuesta de reactividad cruzada. Estos resultados fueron las bases para la elaboración de una hipótesis sobre el papel que podrían desempeñar estas células en el desarrollo de la forma severa de la enfermedad. Kurane y otros plantearon que, durante una infección secundaria por virus dengue, la respuesta de linfocitos T podría inducir la pérdida de plasma, tanto directa como indirectamente a través de la liberación de citoquinas vasoactivas y otros mediadores.1

Estudios filogenéticos de diferentes aislamientos de virus dengue sugieren que este circula de forma natural en un reservorio de la selva, probablemente en primates no humanos,2 por lo que pudiera esperarse que estas especies proveyeran un modelo útil para su estudio. Con este objetivo, varios primates no humanos han sido infectados experimentalmente y se ha comprobado en ellos el desarrollo de una viremia similar a la que tiene lugar en el hombre, pero con bajos títulos de anticuerpos y los animales generalmente no muestran signos de la enfermedad.3 Sin embargo, la respuesta linfoproliferativa no ha sido muy estudiada en estas especies animales.

Métodos

Un grupo de 6 monos Cynomolgus (Maccaca fascicularis), 3 jóvenes y 3 adultos, fueron inoculados con virus dengue 4 (D4) (cepa standard H247) por vía subcutánea, a una concentración de 105 PFU (del inglés plaquet formed unit). Los monos, en su mayoría (5 monos), desarrollaron títulos de anticuerpos (tabla). Se les extrajo, 60 d después, 10 mL de sangre total a los 6 animales para los ensayos de linfoproliferación (ELP).

La sangre heparinizada fue diluida en solución de Hank modificada (sin calcio y magnesio) (Sigma), para el aislamiento de las células mononucleares según el método estándar descrito.4 La suspensión celular se incubó en presencia de los antígenos de dengue 1 (cepa Hawii ), dengue 2 (cepa Nueva Guinea C) y dengue 4 (cepa H242), a las concentraciones de 1,845 µg/mL/2,1×103 PFU, 260 µg/mL/4,5×103 PFU y 930 µg/mL/105 PFU, respectivamente; durante 6 d para el ELP y por un tiempo de 48 h para el fenotipaje celular. La timidina tritiada, a la concentración de 1µCi, fue añadida 6 h antes de culminar el cultivo, en los pozos destinados a la proliferación. Tras 6 h, las placas fueron congeladas a –70 °C hasta su cosechamiento y posterior conteo de emisiones b (cpm). Los resultados se expresaron en índice de estimulación (IE= media cpm/media control cerebro). Se consideraron positivos aquellos que cumplieron con la condición IE ³ 2.

Resultados

Los resultados de este trabajo evidenciaron en los monos utilizados, pertenecientes al género Maccaca, especie fascicularis (Maccaca fascicularis), una respuesta linfoproliferativa específica al virus dengue 4, agente causal de la viremia, así como respuestas reactivas cruzadas marcadas, en 3 de los casos, frente a los serotipos heterólogos. La respuesta específica, como puede observarse en la figura, tuvo una tendencia a ser mayor en los monos jóvenes en comparación con los monos adultos. Esta tendencia también puede observarse en el caso de la respuesta de reactividad cruzada frente al serotipo 2.

A: adulto J: joven
Fig. Respuesta linfoproliferativa frente a los antígenos virales y el control de cerebro.


Discusión

Estos resultados obtenidos en macacos, guardan relación con los hallados por el grupo de Kurane y Rothman en humanos y en ratones, en 1989.5,6 Estos investigadores, en ambas especies, encontraron linfocitos T de memoria CD4+ específicos a virus dengue después de una infección primaria, así como células T de reactividad cruzada a otros serotipos virales. De los resultados de aquellos estudios se concluyó que, en teoría, los linfocitos T podrían ser capaces de responder con acelerada cinética durante una infección secundaria por virus dengue.7 En los experimentos en humanos, la respuesta predominante fue al serotipo viral frente al cual el donor había sido infectado, pero la respuesta cross-reactiva a los serotipos heterológos mostró una variación entre sujetos. Como puede observarse en la figura, la variación en la respuesta cruzada entre individuos también es apreciable en el presente trabajo. Otra coincidencia viene porque fue el serotipo 2 el de mayor reconocimiento cruzado. Esto podría explicarse debido a que, entre las células que proliferan en este experimento se encuentran de clones linfocitos T, los que reconocen con más frecuencia epítopes sobre las proteínas no estructurales altamente conservadas. Un ejemplo en ese sentido parece ser el caso de la serino proteasa del virión NS3 que, al parecer, constituye un blanco para estos linfocitos 8-10 y posee una gran similitud entre los serotipos 2 y 4.11

Por otra parte, los resultados de este estudio muestran que la respuesta proliferativa fue más evidente y acentuada en los monos jóvenes, lo cual guarda cierta similitud con lo que ocurre en humanos. Se plantea que en individuos jóvenes, se encuentran aumentadas las condiciones para una óptima y mantenida activación de las células T.12

Si bien esta especie no constituye un modelo animal que permita descifrar el enigma que encierra el desencadenamiento de la enfermedad por dengue, se puede decir que, los resultados obtenidos guardan similitud a lo estudiado previamente en humanos. Un estudio más profundo en monos de esta especie, que conlleve a establecer correlaciones con los humanos, podría ser de mucha utilidad para explicar con mayor certeza los resultados obtenidos.

Summary

A group of 6 Cynomolgus monkeys was immunized with dengue 4 virus (H247 standard strain). 60 days after innoculation the cellular proliferation against the same serotype as well as against hetereologous serotypes 1 and 2 was measured. A proliferative response predominantly of the specific serotype and some cross reactivity were detected. These results showed a behavior of primates similar in some extent to that of human beings and mice regarding the specific serotype and cross serotype response to dengue virus.

Subject headings: DENGUE VIRUS/immunology; DENGUE/immunology; MACACA FASCICULARIS; DISEASE MODELS, ANIMAL: T-LYMPHOCYTES/immunology.


Referencias bibliográficas

  1. Rothman AL, Ennis FA. Toga/Flaviviruses: Immunopathology En Effects of Microbes on the Immune Sistem. Ed. by N.Wcunningham and R.S.Fujinami. 2000.
  2. Rico-Hesse, R. Molecular evolution and distribution of dengue virus type 1 and 2 in nature. Virology 1990;174:479-93.
  3. Halstead SB, Shotwell H, Casals J. Studies on the pathogenesis of dengue infection in monkeys.II. Clinical laboratory response to heterologous infection. J Inf Dis 1973; 128:15-22.
  4. Boyum A. Isolation of leucocytes from human blood. Isolation of mononuclear cell by one centrifugation and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Lab Invest 1968;21:77-89.
  5. Rothman AL, Kurane I, Zhang YM, Lai CJ, Ennis FA. Dengue virus-specific murine T-lymphocyte proliferation: serotype specificity and response to recombinant viral proteins. J Virol 1989;63:2486-91.
  6. Kurane I, Kontny U, Janus J, Ennis FA. Dengue-2 virus infection of human mononuclear cell lines and establishment of persistent infections. Arch Virol 1990;110:91-101.
  7. Rothman AL, Ennis FA. Immunopathogenesis of Dengue Hemorrhagic Fever. Virology 1999;257:1-6.
  8. Kurane I, Innis BL, Nimmannitya S, Nisalak A, Meager A, Janus J, et al. Activation of T lymphocytes in dengue virus infections. High levels of soluble interleukin 2 receptor, soluble CD4, soluble CD8, interleukin 2, and interferon-g in sera of children with dengue. J Clin Invest 1991;88:1473-80.
  9. Kurane I, Brinton MA, Samson AL, Ennis FA. Dengue virus-specific, human CD4+ CD8- cytotoxic T cell clones. Multiple patterns of virus cross-reactivity recognized by NS3- specific T cell clones. J Virol 1991;65:1823-8.
  10. Mathew A, Kurane I, Rothman AL, Zeng LL, Brinton MA, Ennis FA. Dominant recognition by human CD8+ cytotoxic T lymphocytes of dengue virus nonstructural proteins NS3 and NS1.2a. J Clin Invest 1996;98:1684-94.
  11. Murthy HM, Clum S, Padmanabhan. Dengue Virus NS3 serine protease. J Biol Chem 1999;274:5573-80.
  12. Abbas AK. Efector mechanism of immune response in cellular and molecular immunology.3.ed.1997:250-76.

Recibido: 14 de marzo de 2001. Aprobado: 15 de agosto de 2002.
Lic. Gissel García. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”, Autopista Novia del Mediodía, km 6 ½, La Lisa, Apartado Postal 601. Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: ciipk@ipk.sld.cu

1 Máster en Virología. Licenciada en Bioquímica. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK).
2 Máster en Virología. Licenciada en Microbiología. IPK.
3 Máster en Virología. Licenciada en Microbiología. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB).
4 Médico Veterinario. CIGB.
5 Máster en Infectología. Especialista de I Grado en Inmunología. IPK.
6 Máster en Virología. Licenciada en Radio Química. IPK.
7 Doctora en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. IPK.

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