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Revista Cubana de Plantas Medicinales

On-line version ISSN 1028-4796

Rev Cubana Plant Med vol.10 no.1 Ciudad de la Habana Jan.-Apr. 2005

 

Laboratório de Biotecnologia de Plantas, Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, Brasil

Caracterização de pseudofrutos, frutos, sementes e plântulas obtidas a partir de germinação in vivo e in vitro da espécie medicinal Hovenia dulcis (Rhamnaceae)*

Tatiana Carvalho de Castro,1 Karen Campos Barbosa,2 Norma Albarello3 e Solange Faria Lua Figueiredo4

Resumo

O presente trabalho apresenta características morfológicas do pseudofruto, fruto e semente de Hovenia dulcis, e etapas do desenvolvimento pós-seminal de plântulas obtidas a partir da germinação sob condições in vivo e in vitro. Avaliou-se a influência da interação temperatura (20, 25, 30, 35ºC, 15-25, 20-30ºC) x substrato (papel germitest, areia, vermiculita), determinando-se as condições mais adequadas para a condução do teste de germinação in vivo. O processo germinativo foi acompanhado durante 60 dias, determinando-se a porcentagem, o índice de velocidade e tempo médio de germinação. Avaliou-se, ainda, a metodologia mais eficiente para superação da dormência das sementes submetendo-as a doze tratamentos. Os pseudofrutos de forma irregular são adocicados e comestíveis. Os frutos são esquizocárpicos, de forma globosa. As sementes orbiculares apresentam variações na coloração e no tamanho, ocorrendo com maior freqüência as sementes castanho-claras grandes. O tegumento é constituído por uma camada de macroesclereídeos, que lhe confere dureza e um certo grau de impermeabilidade. A germinação é epígea fanerocotiledonar. Os cotilédones são orbiculares foliáceos e as folhas membranáceas. A interação temperatura x substrato mais adequada para a germinação sob condições in vivo é 20-30 ºC, em vermiculita, com taxas de 70 % de germinação. Os métodos de superação de dormência mais eficientes são a escarificação mecânica associada ou não à imersão em AG3 e o armazenamento à 10 ºC por 7 dias seguido de escarificação mecânica, obtendo-se de 90 a 97 % de germinação. As plantas provenientes de sementes germinadas in vitro possuem características morfológicas semelhantes àquelas germinadas in vivo, apresentando maior desenvolvimento do sistema radicular e do epicótilo, e maior número de folhas, aos 60 dias da semeadura.

Termos para indexação: desenvolvimento pós-seminal, morfologia, planta medicinal, processo germinativo.

Abreviações: MF - matéria fresca, MS - matéria seca, MS - meio de cultura de Murashige & Skoog, MS0 - meio de cultura de Murashige & Skoog sem reguladores de crescimento, RAS - Regras de Análise de Sementes, TTC - cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio, U - grau de umidade

Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) é uma espécie arbórea originária do leste da Ásia, cultivada no Brasil em regiões montanhosas subtropicais, conhecida vulgarmente como uva-do-japão. 14,36 Na medicina popular tem sido utilizada como diurético, antipirético, antiasmático e em doenças do fígado.13,14,18,45 Estudos fitoquímicos e farmacológicos revelaram o grande potencial medicinal da espécie, tendo sido identificadas, nas folhas, saponinas triterpênicas com capacidade de inibir a percepção do sabor adocicado, 41, 42 glicosídeos triterpenóides, em pseudofrutos, frutos e sementes, com atividade anti-histamínica, 43 além de dihidroflavonóides com atividade hepatoprotetora e inibidora do relaxamento muscular.44 Extratos de plantas jovens provenientes de germinação in vivo e propagação in vitro apresentaram atividade antineoplásica, enquanto nos extratos das folhas de plantas germinadas in vivo e de pseudofrutos mostraram atividade tripanocida. 12

Diante da importância medicinal e da necessidade de produção de novas mudas com o objetivo de preservação, torna-se necessário um maior conhecimento fisiológico da referida espécie. A caracterização morfológica dos frutos e sementes associada à fisiologia da germinação é fundamental para o entendimento de processos funcionais e exigências de uma espécie. O conhecimento da morfologia de sementes disponibiliza informações sobre a viabilidade e métodos de armazenamento e semeadura. 24

O estudo da germinação permite conhecer os processos fisiológicos e bioquímicos envolvidos, as relações com os fatores internos e externos, as diferentes etapas do desenvolvimento pós-seminal, as características das plântulas, além das exigências, tolerâncias e capacidade de utilização dos recursos do meio. Fornece, ainda, subsídios para explicar as peculiaridades biogeográficas de uma espécie, visto que a distribuição e as preferências ecológicas, normalmente são determinadas pela faixa de condições ambientais toleradas para a germinação das sementes. 37

A temperatura e o substrato são dois fatores importantes que influenciam o processo germinativo. Os limites de temperatura e os valores ótimos variam para cada espécie,8 exercendo influência marcante sobre a porcentagem, velocidade e uniformidade de germinação, pois afetam a absorção de água e as reações bioquímicas que regulam o metabolismo inicial da germinação.6,11,15 Quanto ao substrato, deve-se considerar sua estrutura, capacidade de retenção de água, aeração, pH e infestação de patógenos. Sua escolha e adequação variam em função do tamanho da semente, sua exigência de água e aeração, sensibilidade à luz e a facilidade que o substrato oferece para o desenvolvimento das plântulas e posterior avaliação do teste germinativo. 9

O processo germinativo é influenciado, também, por fatores intrínsecos resultantes da ação de mecanismos físicos e fisiológicos, que podem bloquear o processo mesmo em condições ambientais de temperatura, umidade e oxigenação favoráveis.6,32 Neste caso, a germinação pode ser induzida através da utilização de métodos de superação de dormência.9
Através de estudos fisiológicos de germinação sob condições in vitro, é possível definir metodologias que garantam o estabelecimento de estoques de plantas matrizes em boas condições fitossanitárias, podendo atender à demanda para protocolos de cultura de tecidos da espécie. 21

Nesse trabalho objetivou-se estudar as características morfológicas de pseudofrutos, frutos, sementes e plântulas, além de avaliar a interação substrato x temperatura e o efeito de métodos de superação de dormência sobre a germinação de sementes de H. dulcis. Analisou-se, ainda, o desenvolvimento pós-seminal de plântulas provenientes de germinação in vivo e in vitro.

Métodos

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biotecnologia de Plantas (LABPLAN-IBRAG-UERJ), durante o período de 1999 a 2001. Exemplares representativos encontram-se depositados no Herbário da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, sob o registro HRJ1426.

Aspectos morfológicos e biométricos de pseudofrutos, frutos e sementes

Pseudofrutos com frutos maduros aderidos, desenvolvidos em espécime localizado no bairro Alto, no município de Teresópolis-RJ, foram coletados após sua queda ao solo nas proximidades da árvore matriz, entre os meses de fevereiro a maio. Foram escolhidos aleatoriamente 30 pseudofrutos, 50 frutos e 100 sementes para a caracterização morfológica e avaliações biométricas. Os pseudofrutos foram avaliados quanto à coloração, dimensões, matérias fresca (MF) e seca (MS) e grau de umidade (U). Nos frutos consideraram-se os seguintes parâmetros: tipo, coloração, dimensões, textura e consistência do pericarpo, deiscência, número de sementes por fruto, MF, MS e U. Para a caracterização das sementes foram observados: forma, coloração, dimensões, textura e consistência do tegumento, MF, MS, U e estruturas internas. As observações e as ilustrações foram feitas com auxílio de um estereomicroscópio Zeiss, com câmara clara acoplada. Para determinação das dimensões (comprimento, largura e espessura) utilizou-se um paquímetro digital, com precisão de 0,1 mm. A determinação do U foi realizada pelo método de estufa a 105±3 ºC por 24 h, de acordo com as Regras de Análise de Sementes (RAS). 9 As aferições de MF e MS foram obtidas com auxílio de balança analítica. A classificação do fruto foi baseada em Barroso e colaboradores 3 e as descrições morfológicas da semente estão de acordo com Beltrati. 5

Tabela 1. Características das sementes de H. dulcis, coletadas de frutos maduros

Coloração etamanho

Freqüência (%)
Dimensões (mm)
MF (mg)
MS (mg)
U (%)
C             L      
E
CaClG
86,2
4,9±0,5
4,5±0,5
2,3±0,2
20,5±2,2
19,1±2,8
6,8
CaClM
5,5
3,6±0,4
3,0±0,3
1,6±0,2
4,7±0,9
4,3±1,0
8,5
CaClP
3,0
3,0±0,2
2,0±0,2
1,5±0,2
2,8±0,5
2,4±0,7
14,3
CaEsM
3,0
3,8±0,4
2,7±0,3
1,4±0,2
4,1±1,1
3,5±0,7
14,6

VEsG

2,3
4,7±0,3
4,0±0,3
2,1±0,3
13,3±3,7
11,2±1,6
15,8

     Ca - castanha; V - verde; Cl - clara; Es - escura; G - grande; M - média; P - pequena; C - comprimento; L - largura; E - espessura; MF - matéria fresca; MS - matéria seca; U - grau de umidade.

Germinação sob condições in vivo

A viabilidade das sementes foi avaliada através do teste topográfico de tetrazólio,9 com três repetições de 20 sementes de cada tipo. Após pré-condicionamento em água destilada à temperatura ambiente por 24 h, as sementes foram seccionadas longitudinalmente e imersas em solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) a 0,1% (w/v), por 24 h a 30 ºC, no escuro. Após este período, as sementes foram lavadas em água corrente e avaliadas, em estereomicroscópio, sendo os resultados expressos em porcentagem de sementes viáveis.

Para avaliar a influência da interação substrato x temperatura sobre a germinação, foram utilizadas sementes íntegras (conforme RAS)9 castanho-claras grandes. Após lavagem com detergente comercial, desinfestação em solução de NaOCl a 2,5% (cloro ativo) com Tween 80 (0,05% v/v) por 2 min, e enxágüe em água destilada estéril, foram colocadas para germinar em caixas plásticas tipo Gerbox (11x11x3,5cm) desinfestadas com NaOCl (2,5%). Foram utilizados como substratos, previamente autoclavados (121 ºC por 30 min): vermiculita expandida de granulação média (121cm3); areia (121cm3) e papel GermitestÒ sanfonado. As sementes foram colocadas para germinar com dois terços de seu volume abaixo da superfície do substrato ou sobre papel, com o hilo voltado para baixo. Os substratos foram umedecidos até a capacidade de campo. Avaliou-se o efeito das temperaturas constantes (20, 25, 30 e 35 ºC) e das alternadas (15-25 ºC e 20-30 ºC). Os experimentos foram conduzidos em câmaras de germinação (JProlab/ modelo JP1000), sob intensidade luminosa de 19,5mmol m-2s-1, fotoperíodo de 8 h e umidade relativa de 80 %. Em cada experimento foram utilizadas três repetições de 20 sementes. Em substrato de papel, registrou-se o início da germinação a partir da protrusão da radícula, e nos substratos vermiculita e areia, a partir da emergência do hipocótilo do substrato, conforme o padrão da espécie.

O processo germinativo foi acompanhado durante 60 dias, com avaliação diária e rega em dias alternados. Foram avaliados os seguintes parâmetros: a) porcentagem média de germinação (G)- resultados expressos em porcentagem de plântulas normais; 26 b) tempo médio de germinação (TMG)-calculado com base no número de sementes germinadas diariamente, com resultados expressos em número de dias; 35 c) índice de velocidade de germinação (IVG)-seguindo metodologia proposta por Maguire 27 com resultados expressos em dias-1; d) freqüência relativa de germinação em função do tempo de incubação - resultados expressos em porcentagem de sementes germinadas diariamente em relação ao total de sementes germinadas ao final do experimento.26 Avaliou-se, também, o comprimento da raiz, hipocótilo e epicótilo e o número de folhas da plântula. O processo germinativo foi considerado concluído quando a plântula apresentava todas as estruturas essenciais (sistema radicular, hipocótilo e epicótilo com o primeiro par de folhas expandido) em perfeito estádio de desenvolvimento, conforme recomendações das RAS. 9

Após determinação da temperatura e do substrato mais adequados, foi estabelecido um experimento utilizando-se 100 sementes castanho-claras grandes íntegras para acompanhar o desenvolvimento pós-seminal das plântulas. A cada avaliação eram removidas cinco sementes e/ou plântulas do substrato, para documentação gráfica, com auxílio do estereomicroscópio Zeiss, com câmara clara acoplada.

O grau de permeabilidade do tegumento foi avaliado com sementes castanho-claras grandes íntegras, após imersão destas em água destilada durante 10 dias a 26±1ºC, com base na MF inicial. Diariamente foi aferida a MF, com posterior troca da água de embebição. Foram utilizadas três repetições de 20 sementes, sendo os resultados calculados em porcentagem de absorção de água e aumento de matéria, em relação à MF inicial.

A partir da melhor interação temperatura x substrato, foi estabelecido um novo experimento para avaliar uma metodologia de superação de dormência. As sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: a) controle; b) imersão de sementes íntegras em água destilada por 24, 72 e 144 h, à temperatura ambiente; c) escarificação mecânica com lixa (nº 120); d) escarificação mecânica associada à imersão em ácido giberélico (AG3) a 145 mM por 24 h; e) armazenamento em câmara seca a 10ºC por 7, 14 e 21 dias, seguido de escarificação mecânica com lixa; f) escarificação química por imersão em solução de ácido sulfúrico (H2SO4) (0,1% v/v), durante 1 e 5 min, sob agitação e posterior lavagem em água corrente, por 30 min; g) imersão em AG3 (145 e 290 mM) por 24 h. As sementes foram colocadas para germinar em caixas Gerbox, com substrato vermiculita, umedecido até a capacidade de campo, em câmara de germinação, a 20-30ºC. Para cada tratamento foram utilizadas três repetições de 20 sementes. Os parâmetros foram os mesmos empregados no experimento da interação substrato x temperatura.

Germinação sob condições in vitro

Sementes castanho-claras grandes, escarificadas com lixa, foram desinfestadas com solução de NaOCl a 5% (cloro ativo) acrescido de Tween 80 (0,05% v/v), por 45 min, e lavadas por três vezes em água destilada estéril. Posteriormente, foram imersas assepticamente em água destilada por 24 h a 26±1ºC, na presença de luz. As sementes foram inoculadas em frascos de vidro (80x60mm), contendo 30 mL de meio Murashige & Skoog 30, com 3 % de sacarose e isento de reguladores de crescimento (MS0). O pH foi ajustado para 5,8 e o meio solidificado com 0,8 % de agar (Merck). Foram utilizados 10 frascos, com cinco sementes em cada, que permaneceram incubadas a 26 ± 1ºC, sob fotoperíodo de 16 h. O processo germinativo foi acompanhado diariamente durante 60 dias, avaliando-se a porcentagem de germinação, o comprimento da raiz, do hipocótilo e do epicótilo e o número de folhas da plântula.

Análise estatística

O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados, sendo cada bloco representado por uma repetição. No experimento da interação substrato x temperatura sobre a germinação, foram considerados como tratamentos a combinação de três substratos com seis temperaturas (esquema fatorial 3 x 6), totalizando 18 tratamentos. Para os tratamentos de superação de dormência foram considerados 13 tratamentos. Os valores de porcentagem de germinação foram previamente transformados em arc sen Ö(x/100). Todos os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5 % de probabilidade (p£0,05), tendo sido utilizado o programa MSTATC.

Resultados e Discussáo

Aspectos morfológicos e biométricos do pseudofruto, do fruto e da semente

Hovenia dulcis apresenta inflorescência em cimeira bípara, cujas hastes tornam-se intumescidas e variam de coloração durante o processo de amadurecimento dos frutos a elas aderidas. São verdes quando os frutos estão imaturos e, marrom-avermelhadas quando estes amadurecem. Apresentam forma irregular, 4,50±0,50 cm de comprimento, 4,00±0,42 cm de largura (Figura 1A), 2,95±1,16 g de MF, 1,41±0,57 g de MS e 52,96% de U. Devido à sua consistência carnosa e suculenta, são comestíveis e, embora popularmente conhecidos como frutos, são classificados como pseudofrutos.

Cada pseudofruto possui um número médio de quatro frutos do tipo esquizocárpico, globoso (Figura 1B), de coloração variando de marrom-clara a marrom-escura, com pericarpo fino, glabro e quebradiço, deiscente, trilocular, encerrando em sua maioria uma semente por lóculo. O fruto apresenta 5,19±0,44 mm de comprimento por 4,98±0,36 mm de diâmetro, MF de 65,70±15,00 mg, MS de 59,10±13,90 mg e 7,20 % de U.

As sementes são orbiculares, ligeiramente achatadas, evidenciando-se uma discreta convexidade na região dorsal e uma proeminência na região ventral (Figura 1C). O tegumento é composto externamente por uma testa lisa (Figura 1D-a), brilhante e transparente, formada por uma camada de macroesclereídeos com arranjo paliçádico, que lhe confere dureza. Esta característica foi também relatada nas espécies Cuscuta campestris 19 e Discaria toumatou, 22 ambas da família Rhamnaceae. O tégmen apresenta aspecto granulado (Figura 1D-b) e coloração que varia de castanho-clara a castanho-avermelhada, sendo responsável pela cor da semente. Aderido ao tégmen, observa-se um endosperma (Figura 1D-c) esbranquiçado, fino e com aspecto mucilaginoso. O hilo é pequeno, elíptico, localizado na base da semente (Figura 1D-d). O embrião é constituído de eixo embrionário e dois cotilédones. O eixo embrionário é oval, curto (l,50±0,10 mm de comprimento por 0,90±0,07 mm de largura no terço médio), de coloração amarelada, localizado na base da semente, com pólo radicular mais externo ao embrião (Figura 1D-e). Não há distinção morfológica entre as diferentes estruturas do eixo embrionário. Os cotilédones são amarelados, volumosos, carnosos, redondos, plano-convexos, com o mesmo formato da semente (Figura 1D-f). O estudo morfológico interno da semente encontra-se em conformidade com a descrição de Martin 28 para a família Rhamnaceae.


Fig.1. A - Aspecto do pseudofruto de H. dulcis com frutos aderidos; B - Detalhe do fruto esquizocárpico globoso; C - Semente; D - Morfologia interna da semente. a - testa; b - tégmen; c - endosperma; d - hilo; e - eixo embrionário; f - cotilédone. Barras: A - 20 mm; B - 3 mm; C - 3 mm; D - 3 mm.

As sementes apresentam variações de coloração e tamanho, com predomínio de sementes castanho-claras grandes (CaClG), que possuem maiores dimensões, MF e MS e o menor U (Tabela 1). Como a maturidade fisiológica da semente e o estádio final do seu desenvolvimento estão associados à máxima MS alcançada e à diminuição do teor de água 7,37, considerou-se dentre os tipos de sementes observadas, que as CaClG atingiram a maturidade. Num estudo sobre restauração florestal na Tailândia, 23 constatou-se que sementes maduras de H.dulcis, coletadas na época de pós-deiscência, apresentavam baixa germinabilidade, e valores de dimensões, MS e U superiores aos observados neste trabalho. Acredita-se que as diferenças observadas com relação às características das sementes sejam decorrentes de condições ambientais a que os indivíduos estejam submetidos 40 e não, ao seu estádio fisiológico.

Os dados obtidos quanto aos aspectos morfológicos do fruto, da semente e da plântula de uma espécie com promissora atuação terapêutica, além de apresentarem potencial sistemático, permitem uma melhor compreensão da fisiologia da germinação.1 Dessa forma, o conhecimento das características da semente e das estruturas relacionadas, contribuem para o maior conhecimento das exigências fisiológicas da espécie, quanto ao seu processo germinativo.

Germinação sob condições in vivo

Influência da interação substrato x temperatura

Pelo teste com TTC, a viabilidade de sementes CaClG variou de 85 a 95%, a de sementes VEsG, ficou em torno de 60 % e as demais se mostraram inviáveis. Desta forma, as sementes CaClG foram as selecionadas para os experimentos subseqüentes.

Através da Tabela 2, pode-se verificar que as temperaturas 20 ºC, 25 ºC, 15-25 ºC e 20-30ºC apresentam os maiores valores médios de germinação, variando entre 47,8 e 58,9 %, sem diferença significativa entre elas. No entanto, observa-se que em termos numéricos, a temperatura alternada de 20-30 ºC, em substrato vermiculita, é a que propicia maior porcentagem de germinação (70%). Nesta temperatura, constata-se um menor TMG e um maior IVG, que não diferem significativamente das temperaturas 25º e 15-25 ºC. As temperaturas constantes de 30 e 35 ºC não são efetivas nos substratos utilizados.

Estes resultados diferenciaram-se dos obtidos com H. dulcis cultivada na Tailândia, 23 onde foram observadas baixas porcentagens de germinação (18-50 %) e falta de sincronismo no processo germinativo, com emergência radicular a partir de 45 dias da semeadura, prolongando-se até 155 dias. Baixas porcentagens de germinação (1,5 %) foram observadas em experimento conduzido na Filadélfia 17 com sementes íntegras da mesma espécie. As diferenças nos resultados podem estar relacionadas a variações ambientais, uma vez que as condições externas atuam sobre o desenvolvimento das plantas, desde a germinação até a senescência. 16

Os substratos vermiculita e papel não apresentam diferença significativa entre eles, mostrando-se os mais eficientes em relação aos valores de G (Tabela 2). Quanto aos parâmetros TMG e IVG, não se verifica diferença significativa entre os substratos, embora o desenvolvimento das plantas seja mais rápido em vermiculita. Quanto aos substratos, deve-se considerar que a capacidade de retenção de água de cada um deles, aliada às características intrínsecas que regulam o fluxo de água para as sementes, podem ter influenciado os resultados. A vermiculita mostra-se o substrato mais adequado para a germinação de H. dulcis.

Tabela 2. Efeito da interação substrato x temperatura sobre a porcentagem média de germinação (G); tempo médio de germinação (TMG - dias) e índice de velocidade de germinação (IVG - dias-1) de sementes castanho-claras grandes íntegras de H. dulcis

Parâmetro avaliado  Temperatura (ºC)
Substrato 20 25 30 35 15-25 20-30 Médias
 Vermiculita 56,7 56,7 6,7 3,3 56,7 70,0 41,7 A
G Areia 36,7 56,7 0 0 43,3 26,7 27,2 B
 Papel 50,0 63,3 0 0 63,3 60,0 39,4 A
CV (%) = 26,6 Médias 47,8 a 58,9 a 2,2 b 1,1 b 54,4 a 52,2 a 
 Vermiculita 34,9 26,4 19,0 30,0 27,5 20,1 27,2 A
TMG Areia 41,3 28,9 - - 29,9 24,3 31,1 A
 Papel 34,1 29,2 - - 25,5 25,6 28,6 A
CV (%) = 33,6 Médias 36,7 a 28,1 b - - 27,6 b 23,3 b 
 Vermiculita 0,029 0,038 0,053 0,033 0,038 0,050 0,039 A   
 IVG Areia 0,027 0,037 - - 0,033 0,041 0,036 A       
 Papel 0,029 0,035 - - 0,039 0,039 0,035 A       
 CV (%) 37,0 Médias 0,028 b 0,036 ab - - 0,036 ab 0,043 a        
         



Médias seguidas pela mesma letra maiúscula nas colunas e minúscula nas linhas não diferem entre si pelo Teste de Tukey, a 5 %.
CV - coeficiente de variação
- valores não calculados devido à ausência de germinação

Albuquerque e colaboradores2 analisando os efeitos da interação substrato x temperatura sobre a germinação de Colubrina glandulosa (Rhamnaceae) verificaram que nas temperaturas de 25 e 20-30 ºC não ocorreram variações significativas na G e no IVG entre os substratos testados (areia, papel, vermiculita), embora os maiores valores para ambos os parâmetros tenham sido obtidos a 20-30 ºC em vermiculita, conforme o observado no presente trabalho. Os efeitos da temperatura sobre a germinação são complexos uma vez que ela interfere na síntese de hormônios vegetais, de modo a alterar seus níveis endógenos, influenciando a regulação do processo germinativo.15 Sementes de muitas espécies requerem flutuação térmica diária para permitir uma maior porcentagem de germinação.34

Através da análise dos polígonos de distribuição de freqüência da germinação (Figura 2), é possível verificar que a temperatura e o substrato influenciam na distribuição da germinação ao longo do tempo. Todos os gráficos possuem caráter polimodal sendo que nas temperaturas constantes de 20 e 25 ºC, independente dos substratos utilizados, observa-se maior assimetria.

Um significado adaptativo a este padrão de distribuição, mostra uma compensação das condições desfavoráveis de temperatura por uma maior distribuição da germinação no tempo, o que aumenta a probabilidade das plântulas encontrarem na natureza condições mais favoráveis. 25 A tendência ao aumento da polimodalidade na distribuição de freqüência para a germinação isotermal também foi encontrada em sementes de Adenanthera pavonina46 e Stryphnodendron polyphyllum.38 A partir dos polígonos, pode-se concluir que as temperaturas alternadas favorecem o sincronismo do processo germinativo de H. dulcis. Na temperatura alternada de 20-30 ºC, que promove a mais alta G em menor TMG no substrato vermiculita, observa-se um desvio do TMG para a esquerda da moda principal da distribuição de freqüência.

As diferenças observadas entre os resultados do teste com TTC e dos experimentos de germinação devem-se, não apenas, a alguma subjetividade na interpretação do teste, mas principalmente, à possibilidade de haver sementes dormentes que respondem positivamente ao teste, porém não germinam quando submetidas ao experimento de germinação.

Fig.2. Influência da interação substrato - temperatura na distribuição da freqüência relativa de germinação de sementes castanho-claras grandes íntegras de H. dulcis ao longo do período de incubação (G= porcentagem média de germinação; TMG= tempo médio de germinação).

Etapas do desenvolvimento pós-seminal

O início da germinação de sementes castanho-claras grandes íntegras em substrato vermiculita a 20-30 ºC é visualizado em torno do 18º dia após a semeadura, com a ruptura do tegumento na região hilar e protrusão da radícula fina e de coloração branca (Figura 3A). No 19º dia, a raiz primária, de forma cilíndrica, atinge 0,4 cm e ocorre a diferenciação do hipocótilo (Figura 3B). A partir do 20º dia, observa-se o crescimento proporcional da raiz primária e do hipocótilo (Figura 3C). No 25º dia, percebe-se que o crescimento do hipocótilo é mais acelerado do que o radicular. A distinção externa entre o hipocótilo e a raiz é percebida pela diferença de pigmentação entre as estruturas e pela menor quantidade de pêlos do hipocótilo. O hipocótilo eleva da superfície do substrato os cotilédones foliáceos que nesta fase encontram-se completamente expandidos, porém, com o tegumento seminal ainda aderido (Figura 3D). Os limbos cotiledonares libertam-se do tegumento em torno do 30º dia da semeadura, permitindo a visualização do epicótilo (Figura 3E). A germinação é do tipo epígea fanerocotiledonar. Em torno do 35º dia da semeadura, observa-se o desenvolvimento do primeiro par de folhas e das raízes secundárias (Figura 3F). O primeiro par de folhas está totalmente expandido por volta do 40º dia, quando a germinação foi considerada concluída, sendo caracterizada a plântula normal, com todas as estruturas essenciais para o perfeito desenvolvimento no campo.

Fig.3. Etapas do desenvolvimento da plântula de H. dulcis a partir de sementes castanho-claras grandes íntegras germinadas em substrato vermiculita a 20-30ºC. A - protrusão radicular (18º dia da semeadura); B - alongamento da raiz primária e diferenciação do hipocótilo (19º dia); C - alongamento da raiz primária e do hipocótilo (20º dia); D - expansão do limbo cotiledonar (25º dia); E - diferenciação do epicótilo (30º dia); F - desenvolvimento do primeiro par de folhas e das raízes secundárias (35º dia). CF - cotilédone foliáceo; FO - folha; HP - hipocótilo; RP - raiz primária; RS - raiz secundária; TEG - tegumento. Barra = 1 cm.

Aspectos morfológicos da plântula e da planta jovem

A plântula normal apresenta sistema radicular axial, com raiz principal cilíndrica, pouco sinuosa, de coloração esbranquiçada, pilosa, medindo entre 3,0 e 4,0 cm de comprimento (Tabela 3), e com raízes secundárias cilíndricas, finas, tenras, pilosas e com a mesma tonalidade. O hipocótilo é cilíndrico, reto, verde-claro, pêlos esparsos e comprimento entre 4,0 e 5,0 cm (Tabela 3). Os cotilédones são opostos, orbiculares, com bordo inteiro, foliáceos, textura lisa, glabros, nervação pouco evidente, discolores (verde-claro na face dorsal e verde-escuro na ventral), medindo 0,5 cm de comprimento por 0,5 cm de largura e inseridos nos nós cotiledonares por meio de pecíolos curtos (0,10 cm de comprimento). O epicótilo é cilíndrico, verde-claro, piloso, com 0,1 a 0,3 cm de comprimento (Tabela 3). O primeiro par de folhas, com filotaxia oposta, é simples, ovalado, com ápice acuminado e base truncada, bordo dentado, peciolado, membranáceo, pêlos esbranquiçados na face adaxial e glabro na face abaxial, nervação camptódroma-broquidódroma, com nervuras impressas na face dorsal e imersas na ventral, discolor (verde-escuro na face adaxial e verde-claro na face abaxial), porém de tonalidade mais clara do que a dos cotilédones, medindo 0,60-0,75 cm de comprimento e 0,38-0,42 cm de largura. O pecíolo é cilíndrico, verde e curto (0,12-0,13 cm de comprimento).

Como o desenvolvimento das plantas foi acompanhado até 60 dias após a semeadura, pode-se observar o surgimento da terceira folha aos 50 dias. Em torno do 60º dia encontra-se completamente distendida, conservando as características morfológicas descritas para o primeiro par de folhas.

Folhas a partir do terceiro nó, com filotaxia espiralada, possuem estípulas finas, ovado-lanceoladas, acuminadas no ápice e cobertas por pêlos brancos, as quais desprendem-se após a queda foliar.

Tabela 3. Desenvolvimento de plantas de H. dulcis provenientes de sementes germinadas sob condições in vivo, em substrato vermiculita a 20-30ºC, e in vitro

Dias após a semeadura In vivo In vitro
 Raiz Nº de (cm) folhasHipocótilo (cm)Epicótilo (cm)Raiz Nº de (cm) folhasHipocótilo (cm)Epicótilo (cm)
200,45±0,09 0,32±0,03- - 0,51±0,10 0,31±0,08- -
25 1,75±0,30 2,42±0,40- -1,45±0,60 1,17±0,30 0,10±0-
30 2,00±0,603,03±0,63 0,09±0,09- 1,50±0,701,25±0,34 0,10±02
353,50±0,61 4,64±0,750,13±0,052 1,67±0,761,27±0,29 0,33±0,152
403,70±0,85 4,84±0,67 0,19±0,142 3,00±1,41 1,39±0,351,85±1,20 4
453,80±0,75 5,15±0,400,25±0,15 23,66±0,90 1,42±0,30 2,32±1,05 4-5
504,06±0,78 5,35±0,45 0,30±0,172-34,25±0,871,53±0,37 2,73±1,525-6
554,46±1,14 5,42±0,440,29±0,27 2-35,10±2,63 2,25±0,35 4,30±2,40 6
60 4,50±1,32 5,50±0,43 0,30±0,232-4 6,57±5,70 2,37±0,73 4,86±1,34 9

Tratamentos de superação de dormência

No teste de avaliação do grau de permeabilidade do tegumento pode-se observar que as sementes, após as primeiras 24 h após de imersão, absorvem menos de 10 % de água. Após 10 dias de embebição, as sementes não são capazes de alcançar valores superiores a 40 % de absorção de água. Diante dos resultados, considera-se que o tegumento oferece um certo grau de resistência à entrada de água.

Através da tabela 4, pode-se constatar que o tratamento de superação de dormência que associou o armazenamento à 10ºC por 7 dias seguido por escarificação mecânica não difere estatisticamente, em relação à G, daqueles de escarificação mecânica seguida ou não de imersão em AG3, imersão em água por 72 e 144 h e imersão em ácido sulfúrico. No entanto, numericamente, os três primeiros tratamentos apresentam médias mais elevadas, sem diferença significativa entre elas, quanto ao IVG e mais baixas quanto ao TMG. O aumento do período de armazenamento a 10ºC para 14 e 21 dias, seguido da escarificação mecânica, é prejudicial ao processo germinativo, reduzindo acentuadamente a G. Este fato decorre da redução da atividade da a-amilase e posterior hidrólise das reservas gerada pela baixa temperatura Metivier. 29 Resultados semelhantes foram observados em Pterogyne nitens 31 e Cassia excelsa. 20

O tratamento químico, com imersão em ácido sulfúrico não é tão eficiente quanto a escarificação mecânica, apresentando valores de TMG próximos do dobro dos TMG destes. O tratamento com imersão em AG3 não apresenta resultados melhores do que os observados no controle.

Analisando os polígonos de distribuição de freqüência relativa da germinação (Figura 4), observa-se que os tratamentos de superação de dormência aceleraram o início do processo. Os tratamentos de escarificação mecânica, de armazenamento a 10ºC por 7 dias + escarificação mecânica e de escarificação mecânica + AG3 (145 mM) promoveram os maiores valores de IVG (Tabela 4), observado pela redução do tempo de início do processo germinativo e pelo deslocamento do TMG para a esquerda nos polígonos de distribuição de freqüência (Figura 4). A escarificação mecânica propicia a mais alta G entre o 9º e o 10º dia da semeadura (80 %), porém mantém uma maior amplitude de emergência radicular, se comparada ao tratamento de armazenamento a 10 ºC por 7 dias + escarificação mecânica e de escarificação mecânica + AG3, os quais apresentam maior sincronização do processo germinativo.

Tabela 4. Efeito de tratamentos de superação de dormência sobre a porcentagem de germinação (G), tempo médio de germinação (TMG) e índice de velocidade de germinação (IVG) de sementes castanho-claras grandes íntegras de H. dulcis, em substrato vermiculita a 20-30 ºC

TratamientosG (%)TMG (dias) IVG (dias-1)
Sem tratamento (controle)70,0 bc22,7 bc0,045 cd
Imersão em água por 24 h70,0 bc23,3 b0,044 d
Imersão em água por 72 h80,0 ab 21,3 bc0,047 cd
Imersão em água por 144 h 83,3 ab 14,1 cd0,071 b
Escarificação mecânica93,3 ab 10,4 d0,096 a
Escarificação mecânica + imersão em ácido giberélico(145mM/24h) 90,0 ab11,3 d0,088 a
Armazenamento a 10ºC por 7 dias + escarificação mecânica96,7 a10,9 d0,093 a
Armazenamento a 10ºC por 14 dias + escarificação mecânica40,0 cd19,0 bcd 0,053 c
Armazenamento a 10ºC por 21 dias + escarificação mecânica 10,0 d 35,7 a 0,029 e
Imersão em ácido sulfúrico (1 min)83,3 ab22,2 bc0,045 cd
Imersão em ácido sulfúrico (5 min)80,0 ab20,8 bc0,048 cd
Imersão em ácido giberélico (145mM)76,7 b23,8 b0,043 d
Imersão em ácido giberélico (290mM) 66,7 bc27,0 ab 0,037 de
CV (%) 12,87 15,0112,16

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo Teste de Tukey, a 5 %.
CV - coeficiente de variação

Fig.4. Influência dos tratamentos de superação de dormência sobre a distribuição da freqüência relativa de germinação de sementes castanho-claras grandes de H. dulcis em substrato vermiculita a 20-30ºC ao longo do período de incubação (G= porcentagem média de germinação; TMG= tempo médio de germinação).

Em diferentes espécies da família Rhamnaceae como Caenothus sanguineus,33 Discaria pubescens, D. nitida e D. toumatou 22 foi observada dupla dormência (tegumento e embrião) nas sementes. Segundo Baskin & Baskin, 4 a impermeabilidade do tegumento de sementes de algumas espécies de Rhamnaceae é a causa principal da dormência física. Desta forma, os experimentos de superação de dormência aplicados às sementes de H. dulcis neste trabalho visaram acelerar e uniformizar o processo germinativo, além de elucidar a provável causa da dormência. O certo grau de impermeabilidade do tegumento, que é superada pela escarificação mecânica com lixa, sugere que a dormência está relacionada com o tegumento e não às características fisiológicas do embrião. A impermeabilidade do tegumento geralmente está associada à presença de uma ou mais camadas de células paliçádicas impermeáveis compostas de esclereídeos. Característica similar foi observada em D.
Toumatou,22 onde foi sugerido que a impermeabilidade poderia ser resultante da deposição de substâncias hidrofóbicas, nas paredes dos macroesclereídeos, recobertos externamente por uma camada cuticular cerosa.

A justificativa da dormência tegumentar em H. dulcis baseia-se no fato de que nos tratamentos em que as sementes foram apenas imersas em AG3, as diferentes porcentagens de germinação não variaram em relação ao controle, provavelmente em decorrência do impedimento físico à entrada da solução hormonal. Isso foi confirmado, pois quando o AG3 foi utilizado após a escarificação mecânica, os resultados não variaram em relação ao tratamento de escarificação mecânica. A constatação de que não há dormência do embrião baseia-se, ainda, nos resultados observados nos tratamentos de exposição à baixa temperatura que visam reduzir o conteúdo de ABA ou outros inibidores da germinação e aumentar a síntese de giberelinas, estimuladoras da germinação. Como não foi constatada diferença significativa entre os tratamentos de armazenamento em baixa temperatura + escarificação mecânica, escarificação mecânica + imersão em AG3 e a escarificação mecânica isoladamente, considera-se este último como o mais adequado para espécimes de H. dulcis cultivados no Rio de Janeiro, por ser o que despende menor período de tempo e o mais econômico.

Germinação sob condições in vitro

Sementes castanho-claras grandes, escarificadas mecanicamente, inoculadas sob condições in vitro apresentam alta porcentagem de germinação (90 %), assemelhando-se aos resultados obtidos na germinação das sementes in vivo, com o mesmo tipo de tratamento.

A protrusão da radícula foi observada aos 13 dias da semeadura. No 18º dia, a raiz primária branca pilosa apresenta cerca de 0,5 cm, e verifica-se a diferenciação do hipocótilo verde-escuro. No 22º dia, observa-se o alongamento da raiz primária e do hipocótilo, e os cotilédones foliáceos expandidos. A visualização do epicótilo ocorre no 26º dia, quando o tegumento desprende-se dos cotilédones. O primeiro par de folhas e as raízes secundárias surgem em torno do 28º dia. O crescimento da raiz principal ocorre proporcionalmente ao do hipocótilo até o 35º dia. A partir deste período, o crescimento do hipocótilo é lento, quando comparado ao das plântulas in vivo (Tabela 3). No 35º dia, o primeiro par de folhas encontra-se totalmente expandido, caracterizando a plântula normal. Os aspectos morfológicos das plântulas assemelham-se àquelas germinadas in vivo.

As plantas jovens apresentam, aos 60 dias da semeadura, sistema radicular e epicótilo mais desenvolvidos, e maior número de folhas do que as plantas provenientes de sementes germinadas in vivo (Tabela 3). Sugere-se que este desenvolvimento seja decorrente do suprimento da fonte de carbono e dos macro e micronutrientes do meio de cultura utilizado.30 Estudos sobre germinação in vitro de Pothomorphe umbellata 39 e de Norantea brasiliensis, 10 também mostraram produção de plantas mais vigorosas quando comparadas às cultivadas in vivo.

Agradecimiento

À Dona Loló (Maria Dolores Formozinno de Sá), por permitir a coleta dos pseudofrutos e dos frutos de Hovenia dulcis, em sua propriedade.

Resumen

Caracterización de pseudofrutos, semillas y plántulas obtenidas a partir de la geminación in vivo e in vitro de la especie medicinal Hovenia dulcis (Rhamnaceae)
Este estudio proporciona información sobre las características morfológicas de pseudofrutos, frutos y semillas de Hovenia dulcis. Fueron estudiados algunos aspectos del desarrollo pos-seminal de plántulas obtenidas a partir de germinación in vivo e in vitro. Fue estudiado el efecto de la interacción entre la temperatura (20,25,30,35 oC, 15-20, 20-30 oC ) y el sustrato ( papel para probar la germinación, arena, vermiculita) para determinar las condiciones más apropiadas para realizar los experimentos de germinación in vivo. El proceso de germinación fue evaluado durante 60 días y se determinó el porcentaje, índice de velocidad y tiempo promedio de germinación. Además, fue evaluada una metodología más eficiente para acelerar el período previo a la germinación de las semillas sometidas a estos tratamientos. Los pseudofrutos son dulces y comestibles. Los frutos son esquizocárpicos, de forma globosa. Las semillas orbiculares presentan variaciones en color y tamaño, con mayor frecuencia se encontraron semillas grandes de color castaño claro. El tegumento está constituido por una capa de macroesclereidos que le confieren dureza y cierto grado de impermebilidad a las semillas. Los cotiledones son orbiculares y foliados y las hojas, membranosas. Las mejores condiciones para la germinación in vivo fue en vermiculita con temperaturas entre 20-30 oC , con tasas de geminación de 70 %. Los métodos más eficiente para acelerar el período previo a la germinación fue la escarificación mecánica asociada o no a la inmersión en AG3 o el almacenamiento a 10 oC por 7 días seguido de escarificación mecánica, se obtiene entre 90 y 97 % de germinación. Las plantas provenientes de semillas germinadas in vitro, poseen características morfológicas semejantes a aquellas germinadas in vivo, sin embargo, las primeras tienen un mayor sistema radicular y epicotilo y mayor número de hojas, después de 60 días de iniciado el experimento.

Palabras claves: Desarrollo postsemanal, morfología, plantas medicinal, proceso germinativo, Hovenia dulcis.

Summary

Characterization of pseudofruits, fruits, seeds and plantules obtained from in vivo and in vitro germination of Hovenia dulcis (Rhamnaceae) medicinal species

The present study provides information on the morphology of the pseudofruit, fruit and seed of Hovenia dulcis. Some aspects of germination stages and features of the seedlings developed from in vivo and in vitro conditions were also studied. The effect of interaction between temperature (20, 25, 30, 35ºC, 15-25, 20-30ºC) and substrate (germitest paper, sand, vermiculite) was also evaluated in order to determine appropriate conditions to lead the in vivo experiments. The germination process was evaluated during 60 days, by determining percentages of normal seedlings, speed germination and mean time to germination. Treatments to overcome dormancy were examined. The pseudofruits are sweetened and edibles. Fruits are schizocarps and globe-shaped. The orbicular seeds presents a variation in size and colouration and frequently they are big and have light brown coloration. The seed coating is composed of a layer of macrosclereids which confer hardness and impermeability characteristics. The germination is epigeous-phanerocotylar. The cotyledon are orbicularis and foliaceous, and the leaves are membranaceous. The best in vivo conditions to germination has been on vermiculite, at alternating temperature of 20-30ºC, with 70 % of germination. The more efficients treatments of dormancy breaking were mechanical scarification joined or not with gibberellic acid (GA3) and mechanical scarification after seven days on storage (10oC), where 90 to 97 % of germination was achieved. Plants from in vitro germination have morphological features similar in vivo ones, nevertheless, in vitro seedlings present a great root system, more leafs and a developed epycotyl too, after 60 days of the test start.

Key words: Postseminal development, morphology, medicinal plant, germinative process.

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Recibido: 21 de julio de 2004. Aprobado: 31 de enero de 2005.
Mestre em Biologia Tatiana Carvalho de Castro. Laboratório de Biotecnologia de Plantas, Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, Brasil.
e-mail:labplan@uerj.br

* Parte da tese apresentada pelo primeiro autor à Universidade do Estado do Rio de Janeiro para obtenção do título de Mestre em Biologia.

1 Mestre em Biologia. Farmacêutica, MS.
2 Bióloga, MS.
3 Professor Assistente, MS.
4 Professor Adjunto, DS.

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