Ciencia Animal

Uso de dos aditivos para mejorar el valor nutritivo de ensilajes mixtos de Cenchrus purpureus x C. glaucum (híbrido OM-22) y Moringa oleífera

R. Rodríguez^{1  *} 
http://orcid.org/0000-0001-8254-7509

Yadiana Ontivero² 

Sarai Gómez¹ 
http://orcid.org/0000-0001-9248-8143

Yaneisy García¹ 
http://orcid.org/0000-0002-7055-4880

Dailyn Sosa¹ 
http://orcid.org/0000-0003-3933-1176

¹Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

²Facultad de Biología, Universidad de la Habana, La Habana, Cuba

Resumen

El objetivo fue evaluar el efecto de la inclusión de tubérculos de boniato (Ipomoea batatas) y Pediococus pentosaceus LB-25 en el valor nutritivo de ensilajes mixtos de Cenchrus purpureus x Cebchrus glaucum (híbrido OM-22) y Moringa oleifera, mediante el análisis de su composición química e indicadores de su fermentación in vitro. Se usó un diseño experimental completamente aleatorizado con arreglo factorial (3x2), donde los factores principales fueron los 3 niveles de inclusión de boniato (0, 25 y 50%) y la inclusión o no del Pediococcus. El 50% de tubérculos disminuyó el rendimiento de MS del ensilado. El nivel de inclusión del boniato disminuyó pH, MS, FDN y FDA, mientras la inclusión de LB-25 solo incrementó FDN de 61.5 a 64.5% (P< 0.05). Ninguno de los dos factores afectó el contenido proteico de los ensilajes (P>0.05). Se observó tendencia al aumento del potencial y la tasa fraccional de producción de gas al incrementarse el nivel de boniato, alcanzándose el mayor potencial en el ensilado Forraje+50% boniato+LB-25 (662.69 mL g MOinc-1). La DAIVMS se incrementó con 50% de boniato (P=0.2101). Se concluye que la inclusión de tubérculos de boniato en ensilajes mixtos de C. purpureus x C. glaucum (híbrido OM-22) y M. oleifera mejoró el valor nutritivo de los materiales conservados, con los mejores resultados cuando se incluyó al 50%. Por su parte, el empleo de la cepa P. pentosaceus LB-25, al 5% (v/p), no influyó en la calidad nutritiva de los ensilajes evaluados, excepto que aumentó el contenido de FDN.

Palabras clave: fermentación; técnica in vitro; tubérculo de boniato; Pediococcus pentosaceusLB-25

El ensilaje es un método de conservación de los nutrientes de los forrajes a partir de su fermentación ácido láctica que realizan bacterias epifitas en condiciones anaerobias (^{Liu et al. 2016}). Se emplea para segregar el exceso de forrajes que se produce en el período lluvioso y poder disponer de este alimento para cubrir parte del déficit de pastos en el período poco lluvioso. Los ensilajes que se producen en el trópico generalmente son de gramíneas forrajeras de bajo valor nutritivo pero alta producción de biomasa, buena proporción de hojas, rusticidad y adaptación a gran diversidad de suelos y condiciones climáticas adversas, destacando las especies del género Cenchrus (^{García et al. 2014}).

Desde hace varias décadas el Instituto de Ciencia Animal (ICA) viene acumulando experiencia en métodos para mejorar el proceso fermentativo y el valor nutritivo de ensilajes de forrajes tropicales, incluyendo variedades e híbridos de Cenchrus. En tal sentido, se ha evaluado el efecto del presecado (^{Michelena y Molina 1990}), la inclusión de arbustivas proteicas como Moringa oleifera y Tithonia diversifolia para incrementar el nivel proteico y mejorar la calidad del ensilado mixto (^{Gutiérrez et al. 2014} y ^{Morales et al. 2016}), el uso de aditivos energéticos como melazas (^{Domínguez et al. 1982}) y tubérculos de boniato (Ipomoea batatas) (^{Rodríguez et al. 2019} y ^{Rodríguez et al. 2020}) para mejorar la disponibilidad de carbohidratos de fácil fermentación, y el empleo de productos biotecnológicos como el VITAFERT que aporta bacterias lácticas, ácidos orgánicos y factores de crecimiento microbiano que favorecen el proceso fermentativo (^{Gutiérrez et al. 2014}, ^{Morales et al. 2016} y ^{Rodríguez et al. 2019}). Recientemente se describió el efecto en el valor nutritivo de ensilajes mixtos al incluir niveles mayores de tubérculos de boniato (hasta 50%, base húmeda) en asociación con el empleo de la cepa pura de Lactobacillus pentosus LB-31 (^{Rodríguez et al. 2020}).

Los aditivos microbianos que se obtienen a partir de cepas puras de bacterias ácido lácticas son inoculantes seguros, fácil de usar, no son corrosivos para la maquinaria agrícola y no contaminan el ambiente (^{Ozduven et al. 2017}). Los más utilizados para estimular la fermentación láctica y mejorar la calidad de los ensilados han sido las bacterias homofermentativas (^{McDonald et al. 1991}), entre ellas se encuentran varias especies de los géneros Lactobacillus, Enterococcus y Pediococcus (^{Muck et al. 2018}), que han mostrado potencialidades para mejorar los procesos fermentativos y garantizar buena calidad del producto obtenido (^{Porto et al. 2017}).

Por ello, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la inclusión de tubérculos de boniato y P. pentosaceus LB-25 en el valor nutritivo de ensilajes mixtos de Cenchrus purpureus x Cenchrus glaucum (híbrido OM-22) y Moringa oleifera, mediante el análisis de su composición química e indicadores de su fermentación in vitro.

Materiales y Métodos

Obtención de los ensilajes Forrajes utilizados en la elaboración de los ensilajes. Las plantas se recolectaron en áreas experimentales del Instituto de Ciencia Animal (ICA) de Cuba. Se recolectaron por corte manual plantas de C. purpureus x C. glaucum (híbrido OM-22) y M. oleifera (moringa) de 90 y 60 días de edad, respectivamente; establecidas en suelo ferralítico rojo típico, de rápida desecación y perfil uniforme (^{Hernández et al. 2015}). Ambos forrajes se pasaron por un molino forrajero hasta alcanzar tamaño de partícula de 20-30 mm y el material molido se extendió para su presecado al sol en una superficie plana con escurrimiento hasta alcanzar MS superior al 30%.

Aditivos utilizados en la elaboración de los ensilajes. Como aditivo energético para incrementar el contenido de carbohidratos de fácil fermentación se empleó tubérculos de boniato. Se utilizaron boniatos de pequeño y mediano tamaño, sin lavar, pero sin tierra adherida. Los tubérculos se cortaron longitudinalmente en trozos y luego se redujo su tamaño lasqueándolos en láminas finas. Este proceso se realizó en el momento en que se prepararon los ensilajes para evitar en lo posible la oxidación de los almidones.

Como aditivo microbiano se utilizó el cultivo puro de la cepa de bacterias ácido-lácticas P. pentosaceus LB-25, obtenida del Banco de Microorganismos del ICA. Esta cepa se identificó por secuenciación del gen 16S ARN ribosomal y su secuencia se encuentra depositada en el GenBank (número de acceso: FR717465). La cepa se cultivó en caldo Rogosa (Oxoid, UK), a 37 ºC, durante 18 a 24 h. Después del período de incubación, se verificó su pureza y se garantizó concentraciones de 109 células·mL-1, determinadas por conteo en cámara de Neubauer.

Elaboración de los microsilos. La elaboración de los microsilos se realizó según la metodología propuesta por ^{Rodríguez et al. (2016)} en tubos de vidrio (120 mm altura x 70 mm diámetro) herméticamente cerrados. Primero se preparó una mezcla con los forrajes a ensilar (OM-22 y moringa, 50:50 en base húmeda), que constituyó el núcleo fibroso y proteico de los ensilados a evaluar. Posteriormente se mezcló este núcleo con los tres niveles de tubérculos de boniato (0, 25 y 50%) y a continuación a todos los tratamientos se les asperjó uniformemente urea (1%) y sulfato de amonio (0.2%), diluidos en agua en una proporción (1:2), también en base húmeda. Terminado el mezclado con la urea y el sulfato de amonio, se dejó reposar 30 minutos antes de añadir el inóculo microbiano a los tratamientos. Para dicha inoculación, se asperjaron 75 mL de medio con el inóculo correspondiente por cada 1,5 kg del material a ensilar para cada combinación de forraje y boniato (5% v/p). A los tratamientos sin inóculo microbiano se le asperjó la misma cantidad de agua destilada para garantizar que todos los tratamientos se humedecieran homogéneamente.

Luego de un último mezclado, los tratamientos se introdujeron en los recipientes de vidrio, por capas que se compactaron con un pisón. Al finalizar, los recipientes se sellaron herméticamente. Los microsilos, con aproximadamente 300 g de materia fresca, se mantuvieron en condiciones de anaerobiosis por un período de 64 días. Los tratamientos evaluados fueron:

• Forraje de OM-22: moringa (F)

• Forraje de OM-22: moringa + 25% tubérculos de boniato (F+25%B)

• Forraje de OM-22: moringa + 50% tubérculos de boniato (F+50%B)

• Forraje de OM-22: moringa + P. pentosaceus LB-25 (F+LB-25)

• Forraje de OM-22: moringa+ 25% tubérculos de boniato+ P. pentosaceus LB-25 (F+25%B+ LB-25)

• Forraje de OM-22: moringa + 50% tubérculos de boniato + P. pentosaceus LB-25 (F+50%B+ LB-25)

Al finalizar el proceso de ensilaje, se abrieron los microsilos y se tomó una muestra de 10 g de cada uno, se le añadió 90 mL de agua destilada y se mezcló en zaranda orbital a 250 rpm durante 15 minutos, a 20ºC. Luego la mezcla se filtró en gasa y al filtrado se le midió pH (pHmetro Everich, PHSJ-3F, China). Adicionalmente, se tomaron aproximadamente 200 g de cada microsilo, se secaron hasta peso constante en estufa de aire forzado, con temperatura regulada (60ºC) y luego se molieron en molino de martillo hasta alcanzar tamaño de partícula de 1 mm. Posteriormente, la mitad del material seco de cada microsilo se almacenó de manera individual en bolsas de nailon selladas para análisis de composición química. El resto del material seco se mezcló homogéneamente por tratamiento y el pool obtenido también se almacenó en bolsas de nailon selladas hasta su empleo en las evaluaciones in vitro.

Evaluación in vitro de la capacidad fermentativa de los ensilados obtenidos. Para evaluar el valor nutritivo de los ensilados mixtos obtenidos se realizaron dos ensayos in vitro, en los cuales se utilizó la técnica de producción de gas descrita por ^{Theodorou et al. (1994)}. Se incubó 1,0 g de cada tratamiento en botellas de vidrio de 100 mL, con medio de cultivo (^{Menke y Steingass 1988}) e inóculo de microorganismos ruminales en proporción de 0,20 mL del volumen total de incubación (80 mL).

Se utilizó como inóculo el contenido ruminal de dos vacas de raza Siboney, adultas, estabuladas, alimentadas ad libitum con forraje de gramíneas y con libre acceso a agua y sales minerales. El contenido ruminal se recolectó a través de la cánula ruminal, antes de ofrecer el alimento en la mañana, y se conservó en termos cerrados independientes hasta llegar al laboratorio, donde se filtraron a través de gasa y se mezclaron en proporciones iguales. Durante el proceso, se mantuvo la temperatura de los inóculos a 39±1ºC, y condiciones anaeróbicas mediante flujo continuo de CO2. Las botellas se sellaron y se incubaron en baño, a temperatura controlada (39ºC). Se tomó ese momento como la hora cero de la incubación. En ambos ensayos se incubaron botellas sin sustrato como blancos.

En el primer ensayo, para determinar la cinética de fermentación in vitro de los ensilados obtenidos se midió la producción de gas hasta las 144 h, por medio de un manómetro HD8804 acoplado a un calibrador de presión TP804 (DELTA OHM, Italia). Después de cada medición, se liberó el gas hasta igualar las presiones externa e interna de las botellas. Se estimó el volumen de gas a partir de los datos de presión, mediante una ecuación de regresión lineal pre-establecida (^{Rodríguez et al. 2013}). El volumen de gas se expresó por gramo de materia orgánica (MO) incubada (MOinc). Para estimar la cinética de producción de gas, se utilizó el modelo exponencial descrito por ^{Krisnamoorthy et al. (1991)}:

[TeX:] Y= D [1-Exp (-c (t- L))]

Donde, Y es la producción de gas acumulada (mL g-1 MOinc) a un tiempo de incubación t (h), D es el potencial de fermentación del sustrato en las condiciones de incubación (asíntota de la curva, mL g-1 MOinc), c es la tasa fraccional de fermentación (h-1) y L es la fase Lag de la fermentación (h).

En el segundo ensayo, la producción de gas se midió solo hasta las 24 horas de incubación (3, 6, 9, 12, 18 y 24 h). Al finalizar la incubación se abrieron las botellas y su contenido se filtró a través de bolsas de nailon (50 μm de porosidad y área superficial de 28 cm2), taradas previamente en balanza analítica (Sartorius BL 1500, ± 0,0001). Las bolsas con los residuos de la fermentación se secaron hasta peso constante en una estufa de aire forzado con temperatura regulada a 60ºC, durante 72 horas. Por este medio se determinó por gravimetría la degradabilidad aparente in vitro de la MS (DAIVMS) de los ensilajes evaluados, como la diferencia entre el sustrato incubado y el residuo de la fermentación, expresado como proporción del sustrato incubado y multiplicado por 100 (%).

Además, del filtrado se tomaron 5 mL de muestra para determinar el contenido de NH3, los que se preservaron y conservaron hasta el momento de su análisis.

Análisis químico. Para determinar la composición química de los ensilados, se les determinó MS, MO y proteína bruta (PB) (^{AOAC 2016}). La fibra detergente neutro (FDN) y la fibra detergente ácido (FDA) se cuantificaron por el procedimiento descrito por ^{Van Soest et al. (1991)}. Para obtener la concentración de amoníaco en el ensayo in vitro, se utilizó la técnica colorimétrica propuesta por ^{Chaney y Marbach (1962)}.

Análisis estadístico. Para el análisis de la composición química de los ensilajes evaluados, se empleó un diseño experimental completamente aleatorizado con arreglo factorial (3x2), donde los factores principales fueron los 3 niveles de inclusión de boniato (0, 25 y 50%) y la inclusión de aditivo microbiano (sin aditivo y con P. pentosaceus LB-25). Los microsilos se consideraron como unidad experimental (5).

En el ensayo in vitro de 24 h se empleó un diseño de bloques al azar con arreglo factorial (3x2), donde los factores analizados fueron los mismos que en el caso anterior y las incubaciones se consideraron como bloque (4). En este experimento las botellas se consideraron como unidad experimental (3 botellas por tratamiento).

En ambos casos, las variables se analizaron por ANOVA. Cuando se hallaron diferencias (P<0.05), las medias de los tratamientos se compararon por la dócima de rangos múltiple de ^{Duncan (1955)}. Para estos análisis se empleó el paquete estadístico InfoStat (^{Di Rienzo et al. 2012}).

En el caso de la variable producción de gas acumulada in vitro se dividió a priori la fermentación en dos fases. La primera fase incluyó tres horarios de muestreo entre el inicio y las 9 horas de incubación (3, 6 y 9 h) y la segunda fase se consideró desde ese instante hasta el final de la incubación (12, 16 y 24 h). Como la producción acumulada de gas in vitro es medida repetida en el tiempo sobre la misma unidad experimental, se empleó la metodología propuesta por ^{Gómez et al. (2019)}. Para el análisis de estos datos se empleó el paquete estadístico ^{SAS (2013)}, versión 9.3.

Resultados y Discusión

La composición química de los forrajes y el tubérculo de boniato utilizados en la producción de los ensilajes se informó previamente (^{Rodríguez et al. 2020}). En todos los casos, los valores de MS de los forrajes fueron superiores al 30% según sugieren ^{Michelena y Molina (1990)}.

Al evaluar el efecto de los aditivos en el rendimiento de MS, estimado como la proporción entre la MS de los ensilajes obtenidos y la MS de los materiales a conservar y expresado como por ciento, no se apreció interacción entre los factores ni efecto del aditivo microbiano LB-25 (P>0.05). Sin embargo, el nivel de inclusión de boniato sí afectó este indicador (P<0.05) al disminuir con el 50% de inclusión del tubérculo (figura 1). En todos los tratamientos el rendimiento de MS mostró valores superiores al 96.6%, lo cual pudo estar relacionado con los altos niveles de MS de la mezcla de forrajes conservada y al tipo de microsilo utilizado en el estudio, que no tiene pérdidas por lixiviación.

En cuanto al pH, no hubo interacción entre los efectos de los dos aditivos evaluados ni efecto del aditivo microbiano LB-25 (P>0.05). Sin embargo, la inclusión del boniato influyó en este indicador de la fermentación (P=0.003) aunque no se apreció diferencias entre 25 y 50% de tubérculos (figura 2).

Los valores elevados de pH observados en los tratamientos sin boniato no afectaron las características organolépticas de los microsilos ni se hallaron indicios de putrefacción o presencia de hongos filamentosos. El valor máximo de pH para obtener un ensilaje de calidad se plantea entre 3.8 y 4.2 (^{McDonald et al. 1991}). Sin embargo, otras investigaciones también han observado que a altos contenidos de MS de los forrajes a ensilar se pueden obtener buenos productos conservados a pH más elevados (^{Castle y Watson 1984} y ^{Dumont 1994}). De hecho, se plantea que es común encontrar ensilajes con valores de pH más altos cuando se han confeccionado con forrajes presecados (^{dos Santos et al. 2013})

Figura 1 Efecto del nivel de inclusión del aditivo energético en el rendimiento de MS (%) de los ensilajes evaluados (EE= ± 3.12). 

Tampoco hubo interacción de los factores evaluados en los indicadores de la composición química (P>0.05). Al analizar los factores individuales, se observó que el nivel de boniato incidió en MS, MO, FDN y FDA (P<0.0001), mientras que la inclusión de la cepa LB-25 incrementó la FDN (P=0.048). Ninguno de los aditivos tuvo efecto en el contenido de PB de los ensilajes evaluados (P>0.05) y los valores obtenidos para este indicador fueron superiores al 10.0% para todos los tratamientos.

En la tabla 1 se muestra el efecto del nivel de inclusión de boniato y de la inclusión de LB-25 en los indicadores de composición química de los ensilados evaluados. Los contenidos de MS y FDN disminuyeron al incrementar el nivel de tubérculo debido a que se sustituyó el núcleo de forrajes preseco por un material fresco con menor contenido de MS y fibra (P<0.0001). Sin embargo, el contenido de MO se incrementó y el de FDA disminuyó cuando se incluyó 25% del tubérculo (P<0.0001), pero en ambos casos no se apreció diferencia entre los ensilajes con 25 y 50% de este aditivo.

Aun cuando se apreciaron diferencias en el contenido de MS, todos los tratamientos evaluados mostraron MS superiores al 30% que es el valor mínimo recomendado para obtener ensilajes de calidad (^{Michelena y Molina 1990}). Los altos tenores de FDN obtenidos podrían estar asociados a la edad de corte de los forrajes y a la desaparición de material soluble durante la fermentación anaeróbica (^{Rodríguez et al. 2016} y ^{Rodríguez et al. 2019}). Por su parte, el incremento en la MO se puede relacionar con el mayor contenido de MO del boniato.

Figura 2 Efecto del nivel de inclusión del aditivo energético en el pH de los ensilajes evaluados (EE= ± 0.11). 

Dado el bajo contenido proteico de los tubérculos de boniato, se esperaba una disminución del contenido de PB con el incremento de este aditivo en el ensilaje, tal como hallaron ^{Neiva et al. (2001)} al aumentar los niveles de caña de azúcar como fuente de carbohidratos solubles. Sin embargo, el que no hubiera diferencias pudo estar asociado a que la disponibilidad de carbohidratos no estructurales aportados por el tubérculo pudo favorecer procesos de retención del nitrógeno a través de síntesis de proteína microbiana. En todo caso, los valores de PB encontrados fueron superiores a los 6-8% PB que sugirió ^{Mertens (1994)} como contenido mínimo para que este nutriente no limite la fermentación de carbohidratos por los microorganismos del rumen.

Tabla 1 Efectos de la inclusión del boniato y de la cepa LB-25 en la composición química de los ensilajes evaluados. 

Nivel de Boniato
Tubérculo (%)	MS (%)	MO (%)	FDN (%)	FDA (%)	PB (%)
0	45,4^c	89,0^a	70,2^c	51,0^b	10,6
25	38,7^b	89,8^b	62,3^b	44,3^a	10,9
50	32,2^a	90,0^b	55,8^a	41,5^a	11,4
EE	0,52	0,12	1,14	1,13	0,30
p	<0,0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001	0,2404
Inclusión de LB-25
LB-25	MS (%)	MO (%)	FDN (%)	FDA (%)	PB (%)
Sin LB-25	39,0	89,5	61,5	44,7	11,0
Con LB-25	39,0	89,7	64,6	46,8	10,9
EE	0,41	0,09	0,90	0,90	0,24
P	0.3996	0,2898	0,0480	0,1695	0,7224

Respecto al efecto de la inclusión del aditivo microbiano LB-25 en el contenido de FDN, resultados similares encontraron ^{Junges et al. (2013)} al evaluar como aditivo microbiano una mezcla de L. plantarum, L. brevis y E. faecium. Estos autores relacionaron este incremento del contenido de FDN al incluir aditivos microbianos, con la fermentación de parte de los componentes solubles del forraje a conservar por las bacterias inoculadas, lo que conlleva al aumento proporcional de los componentes insolubles. Sin embargo, ^{Ozduven et al. (2017)} al inocular con L. buchneri y P. acidilactici observaron que estos microorganismos mejoraban las características de la fermentación y disminuían el contenido de FDN y FDA de ensilajes de plantas de girasol.

Fermentación in vitro de los ensilados. En la tabla 2 se muestran los parámetros de las ecuaciones de mejor ajuste a los datos experimentales obtenidos según el modelo de exponencial de ^{Krishnamoorthy et al. (1991)}, que fue capaz de explicar alto por ciento de la variabilidad de los datos de producción acumulada de gas in vitro de todos los tratamientos (R2 > 0.9783).

Se pudo apreciar que el potencial de producción de gas (parámetro D) tendió a incrementarse con el nivel de inclusión de boniato. Igual tendencia se apreció para el aditivo microbiano cuando se empleó con los forrajes solo y 50% de boniato. Respecto a la tasa fraccional o parámetro c, también se apreció una tendencia a incrementarse al incluir boniato, pero a igual nivel de inclusión del tubérculo no se observó diferencias en las magnitudes de este parámetro al incluir o no el aditivo microbiano. Por su parte, la fase Lag (parámetro L) mostró una tendencia inversa pues al incluir boniato el tiempo requerido para comenzar la fermentación tendió a disminuir, pero al igual que para la tasa fraccional este indicador no se afectó con la inclusión de la cepa de Pediococcus.

El incremento del potencial y la tasa fraccional de producción de gas cuando se incluyó boniato pudo estar dado por la mayor cantidad de carbohidratos solubles disponibles para la fermentación, lo que corrobora el incremento del valor nutritivo de los ensilados al incluir este aditivo energético. Respuestas similares se observaron al sustituir forraje de Cenchrus por forraje de T. diversifolia de mejor calidad (^{Morales et al. 2016}) o incluir hasta 15% de boniato en ensilajes mixtos de Cenchrus y M. oleifera (^{Rodríguez et al. 2019}).

Para la variable producción acumulada de gas in vitro, no hubo interacción entre el nivel de boniato, la inclusión o no de LB-25 y los horarios de muestreo, en las dos fases de la fermentación en que a priori se distribuyeron los horarios de muestreo (P> 0.05).

En la tabla 3 se muestran los efectos individuales de los factores analizados en la producción acumulada de gas in vitro. Se apreció que el efecto del aditivo energético en la producción acumulada de gas tuvo en ambas fases de la fermentación el siguiente comportamiento: nivel 50%> nivel 25%> nivel 0% (P<0,0001). De igual forma, se observó que el aditivo microbiano mejoró la producción de gas en la segunda fase de la fermentación (P=0.0470). Respecto al factor horario de muestreo, en ambas fases la producción de gas se incrementó en el transcurso del tiempo (P<0,0001).

Tabla 2 Parámetros cinéticos de la curva de producción acumulada de gas in vitro al fermentar los ensilados evaluados, según modelo exponencial de ^{Krishnamoorthy et al. (1991)}. 

Tratamientos	Parámetro D* (mL g-1 MOinc)	EE	Parámetro c (h-1)	EE	Parámetro L (h)	EE	EE curva	R2
F	433,97	8,590	0,04	0,003	7,25	0,397	20,109	0,9835
F + 25% B	543,10	10,177	0,05	0,003	6,88	0,381	26,528	0,9815
F + 50% B	619,63	11,919	0,05	0,003	6,87	0,384	32,264	0,9790
F+ LB-25	468,57	10,682	0,04	0,003	7,34	0,459	23,265	0,9810
F + 25% B+ LB-25	538,24	11,189	0,05	0,003	6,83	0,430	28,362	0,9783
F + 50% B+ LB-25	662,69	11,502	0,05	0,003	6,82	0,351	30,795	0,9831

*En todos los casos los parámetros fueron significativos (P< 0.0001)

Tabla 3 Efecto del nivel de boniato, la inclusión de LB-25 y horario de muestreo en la producción acumulada de gas in vitro (mL g-1 MOinc) durante las dos fases de la fermentación 

Nivel de Boniato (%)
Tubérculo (%)	PGAS Fase I		PGAS Fase II
0	32,1^a		137,2^a
25	55,3^b		187,3^b
50	60,7^b		225,7^c
EE	2,12		3,78
P	<0,0001		<0,0001
Inclusión de LB-25
LB-25	PGAS Fase I		PGAS Fase II
Sin LB-25	48,2		179,0
Con LB-25	50,5		187,8
EE	1,73		3,09
P	0,3340		0,0470
Horarios de muestreo dentro de una misma fase (h)
Horario (h)	PGAS Fase I	Horario (h)	PGAS Fase II
3	13,3a	12	128,4a
6	47,0b	18	186,9b
9	87,8c	24	234,9c
EE	2,12	EE	3,78
P	<0,0001	P	<0,0001

Indicadores de la fermentación in vitro de los ensilados. A las 24 horas no hubo interacción entre el nivel de tubérculo y la inclusión del aditivo microbiano, ni efecto de la inclusión del LB-25 en la DAIVMS (P>0.05). Sin embargo, el nivel de boniato sí influyó en este indicador gravimétrico (figura 3). La DAIVMS se incrementó con el 50% de inclusión del tubérculo, pero no se apreció diferencias entre los otros dos niveles de inclusión (P=0.0207).

Figura 3 Efecto del nivel de inclusión de tubérculo de boniato en la DAIVMS (%) a las 24 h de fermentación de los ensilajes evaluados. 

La DAIVMS observada fue superior a la reportada por ^{Rodríguez et al. (2019}) para ensilados de C. purpureus (vc. Cuba CT-169) y M. oleifera, con la misma edad de corte y la inclusión de niveles inferiores de boniato (5, 10 y 15%). Esto reafirma la importancia de incrementar los niveles de inclusión de aditivos energéticos en ensilajes mixtos de forrajes tropicales, para mejorar tanto las condiciones de fermentación para su conservación como su calidad nutritiva como alimento para rumiantes (^{Mühlbach 2001}).

Para el N-NH3 tampoco hubo interacción entre el nivel de boniato y la inclusión de LB-25, ni efecto del aditivo microbiano (P>0.05). Sin embargo, el nivel de boniato influyó en este indicador (P<0.05), al observarse un incremento al incluir 25 y 50% del tubérculo en relación con el ensilaje con solo forrajes (Figura 4).

Los resultados obtenidos mostraron mayores concentraciones ruminales de N-NH3 que los informados por ^{Rodríguez et al. (2019)}. Estas diferencias pudieron estar dadas por los mayores niveles de moringa utilizados y por la inclusión de urea en las mezclas a ensilar. Además, en todos los tratamientos se observaron concentraciones de N amoniacal por encima de los 20 mg 100 mL, superiores a los valores ruminales considerados óptimos para maximizar la síntesis de proteína microbiana (2 - 13 mg 100 mL-1) y la tasa de fermentación ruminal de los alimentos (3 - 25 mg 100 mL-1) (^{Boucher et al. 2007}).

Figura 4 Efecto del nivel de inclusión del aditivo energético en el N amoniacal (mg 100 mL-1) a las 24 horas de fermentación in vitro de los ensilajes evaluados (EE= ± 3.94). 

La falta de efectos del aditivo microbiano, excepto en el contenido de FDN del ensilaje y en la producción acumulada de gas in vitro desde las 12 a las 24 h, pudo estar relacionado con las especies forrajeras conservadas. Un meta-análisis de 130 artículos mostró que el efecto de los aditivos microbianos varía según la especie de forraje (^{Oliveira et al. 2017}). Ese estudio demostró que el uso de aditivos microbianos, independientemente de la especie forrajera conservada, mejoraba la producción de ácido láctico y reducía las concentraciones de ácido butírico y nitrógeno amoniacal en el ensilaje. Sin embargo, los inóculos reducían el pH en muchos forrajes templados y tropicales, incluso leguminosas, pero no influía en este indicador cuando se conservaba maíz, sorgo y caña de azúcar. De igual manera, observaron que no influía en el rendimiento de silos de maíz y sorgo, y este indicador empeoraba en ensilajes de caña de azúcar.

Conclusiones

La inclusión de tubérculos de boniato en ensilajes mixtos de C. purpureus x C. glaucum (híbrido OM-22) y M. oleifera mejoró el valor nutritivo de los materiales conservados, con los mejores resultados cuando se incluyó al 50%. Por su parte, el empleo de la cepa P. pentosaceus LB-25, al 5% (v/p), no influyó en la calidad nutritiva de los ensilajes evaluados, excepto que aumentó el contenido de FDN.

References

AOAC (Association of Official Analytical Chemists). 2016. Official Methods of Analysis of AOAC International. 20th Ed. George W. Latimer Jr (ed). Ed. AOAC International, Rockville MD, USA, ISBN: 978-0935-584-875.

Boucher, S.E., Ordway, R.S., Whitehouse, N.L., Lundy, F.P., Kononoff, P.J. & Schwab, C.G. 2007. "Effect of Incremental Urea Supplementation of a Conventional Corn Silage-Based Diet on Ruminal Ammonia Concentration and Synthesis of Microbial Protein". Journal of Dairy Science, 90: 5619-5633, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2007-0012.

Castle, M.E. & Watson, J.N. 1984. "Silage and milk production: A comparison between unwilted and wilted grass silages". Grass and Forage Science, 39(2): 187-193, ISSN: 1365-2494, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2494.1984.tb01680.x.

Chaney, A.L. & Marbach, E.P. 1962. "Modified reagents for determination of urea and ammonia". Clinical Chemistry, 8(2): 130-132, ISSN: 0009-9147, DOI: https://doi.org/10.1093/clinchem/8.2.130.

Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.G., González, L., Tablada, M. & Robledo, C.W. 2012. InfoStat. version 2012, [Windows], Universidad Nacional de Córdoba, Argentina: Grupo InfoStat. Available: http://www.infostat.com.ar

Domínguez, G.H., Hardy, C. & Ayala, J.R. 1982. "Effect of cutting age and final molases levels on the quality of King grass silage (P. purpureum x P. typhoides) ". Cuban Journal of Agricultural Science, 16(1): 89-94, ISSN: 2079-3480.

Dos Santos, R.J.C., Andrade, M., Guim, A., dos Santos, M.V.F., Batista, J.C. & de Leão de Mello, A.C. 2013. "Elephant grass clones for silage production". Scientia Agricola, 70(1): 6-11, ISSN: 1678-992X, DOI: https://doi.org/10.1590/S0103-90162013000100002.

Dumont, J.C. 1994. Análisis y composición química de ensilajes. In: ΙΙ Seminario “Producción y utilización de ensilajes de pradera para agricultores de la zona sur”. González, M. & Bortolameolli, G. (eds.). Ed. Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Estación Experimental Remehue, Serie Remehue, nº 52, p: 27-37.

Duncan, D.B. 1955. "Multiple Range and Multiple F Tests". Biometrics, 11(1): 1-42, ISSN: 0006-341X, DOI: https://doi.org/10.2307/3001478.

García, L.M., Mesa, A.R. & Hernández, N. 2014. "Forage potential of four cultivars of Pennisetum purpureum on a Grayish Brown soil of Las Tunas". Pastos y Forrajes, 37(4): 413-419, ISSN: 0864-0394.

Gómez, S., Torres, V., García, Y., Herrera, M., Medina, Y. & Rodríguez, R. 2019. "Statistical procedure for the analysis of experiments with repeated measures over time in the agricultural and livestock field". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(4): 353-360, ISSN: 2079-3480.

Gutiérrez, D., Morales, A. Elías, A. García, R. & Sarduy, L. 2014. "Chemical composition and in situ ruminal degradability of dry matter in mixed silages of Tithonia diversifolia: Pennisetum purpureum cv. Cuba CT-169, inoculated with VITAFERT". Cuban Journal of Agricultural Science, 48(4): 379-385, ISSN: 2079-3480.

Hernández, A., Pérez, J.M., Bosch, D. & Castro, N. 2015. Clasificación de los suelos de Cuba. Ed. INCA. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, p. 93, ISBN: 978-959-7023-77-7.

Junges, D., Schmidt, P., Ortiz, C. & Pratti, J.L. 2013. "Additive containing homo and heterolactic bacteria on the fermentation quality of maize silage". Acta Scientiarum. Animal Sciences, 35(4): 371-377, ISSN: 1806-2636, DOI: https://doi.org/10.4025/actascianimsci.v35i4.18833.

Krishnamoorthy, U., Soller, H., Steingass, H. & Menke, K.H. 1991. "A comparative study on rumen fermentation of energy supplements in vitro". Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 65(1-5): 28-35, ISSN: 1439-0396, DOI: https://doi.org/10.1111/j.1439-0396.1991.tb00237.x.

Liu, Q.H., Shao, T. & Bai, Y.F. 2016. "The effect of fibrolytic enzyme, Lactobacillus plantarum and two food antioxidants on the fermentation quality, alpha-tocopherol and beta-carotene of high moisture napiergrass silage ensiled at different temperatures". Animal Feed Science and Technology, 221 (Part A): 1-11, ISSN: 0377-8401, DOI: https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2016.08.020.

McDonald, P., Henderson, A.R. & Heron, S.J.E. 1991. Principle of Ensilage. In: The Biochemistry of Silage. 2nd Ed. McDonald, P., Henderson, A. R. & Heron, S.J.E. (eds). Ed. Chalcombe, Marlow, England, p. 9-40, ISBN: 978-0948617225.

Menke, K.H. & Steingass, H. 1988. "Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid". Animal Research and Development, 28: 7-55, ISSN: 0340-3165.

Mertens, D.R. 1994. Regulation of forage intake. In: Forage quality, evaluation and utilization. Fahey Jr., G.C. (Ed.). American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA, p.450-493, ISBN: 9780891185796, DOI: https://doi.org/10.2134/1994.foragequality.c11

Michelena, J.B. & Molina, A. 1990. "The effect of time of sun exposure of King grass (hybrid Pennisetum) on silage quality". Cuban Journal of Agricultural Science, 24(2): 219-224, ISSN: 2079-3480.

Morales, A., Rodríguez, R., Gutiérrez, D., Elías, A., Gómez, S. & Sarduy, L. 2016. "Evaluación de la inclusión de VITAFERT en el valor nutritivo de ensilajes de Tithonia diversifolia y Pennisetum purpureum". Cuban Journal of Agricultural Science, 50(4): 619-630, ISSN: 2079-3480.

Muck, R.E., Nadeau, E.M.G., McAllister, T.A., Contreras-Govea, F.E., Santos, M.C. & Kung Jr., L. 2018. "Silage review: Recent advances and future uses of silage additives". Journal of Dairy Science, 101(5): 3980-4000, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2017-13839.

Müehlbach, P.R.F. 2001. Uso de aditivos para mejorar el ensilaje de los forrajes tropicales. Estudio FAO: Producción y Protección Vegetal. Available: <http://www.fao.org/3/X8486S/x8486s0b.htm>, [Consulted: April 22th, 2020]

Neiva, J.N.M., Ferreira, A.C.H. & Teixeira, M. 2001. Uso de caña de azúcar (Saccharum officinarum) deshidratada como aditivo en el ensilaje de pasto elefante (Pennisetum purpureum). Cartel Técnico 9.2. In: Uso del ensilaje en el trópico privilegiando opciones para pequeños campesinos. Memorias de la Conferencia Electrónica de la FAO sobre los Ensilajes Tropicales. ´tMannetje, L. (ed.). Ed. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. Rome, Italy, p. 175-176, ISBN: 92-5-304500-0

Oliveira, A.S., Weinberg, Z.G., Ogunade, I.M., Cervantes, A.A.P., Arriola, K.G., Kim, Y.D., Li, X., Gonçalves, M.C.M., Vyas, D. & Adesogan, A.T. 2017. "Meta-analysis of effects of inoculation with homofermentative and facultative heterofermentative lactic acid bacteria on silage fermentation, aerobic stability, and the performance of dairy cows". Journal of Dairy Science, 100(6): 4587-4603, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2016-11815.

Ozduven, M.L., Okuyucu, B., Büyükkiliç Beyzi, S. & Konca, Y. 2017. "The effects of lactic acid bacterial inoculants on the fermentation, aerobic stability and nutritive value of sunflower silages". International Journal of Current Research, 9(7): 54289-54295, ISSN: 0975-833X.

Pahlow, G., Muck, R.E., Driehuis, F., Oude Elferink, S.J.W.H. & Spoelstra, S.F. 2003. Microbiology of ensiling. In: Silage Science and Technology. Volume 42. Buxton, D.R., Muck, R.E. & Harrison, J.H (eds). American Society of Agronomy, Inc., Crop Science Society of America, Inc., Soil Science Society of America, Inc., Madison, Wisconsin, USA, p. 31-93, ISBN: 9780891182344, DOI: https://doi.org/10.2134/agronmonogr42.c2.

Porto, M.C., Kuniyoshi, T.M., Azevedo, P.O.S., Vitolo, M. & Oliveira, R.P.S. 2017. "Pediococcus spp.: An important genus of lactic acid bacteria and pediocin producers". Biotechnology Advances, 35(3): 361-374, ISSN: 0734-9750, DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2017.03.004.

Rodríguez, R., Elías, A., Herrera, F., González, N., Moreira, O., Gutiérrez, D., Gómez, S., Sarduy, L. & Medina, Y. 2016. "Valor nutritivo de ensilajes mixtos Pennisetum purpureum (vc. CUBA CT-169): Moringa oleifera: Ipomoea batata, inoculados con el producto biológico VITAFERT". Available: <http://www.engormix.com/MA-ganaderia-carne/nutricion/articulos/cuba2015-valor-nutritivo-ensilajes-t39536/141-p0.htm>, [Consulted: April 25th, 2020].

Rodríguez, R., Herrera, F., Gómez, S., González, N., Alonso, J., Elías, A., Moreira, O., Sarduy, L. & Medina, Y. 2019. "Effects of including sweet potato (Ipomoea batatas) and Vitafert as additives on the nutritional value of Cenchrus purpureus cv. CUBA CT-169 and Moringa oleifera silages". Cuban Journal of Agricultural Science, 53(2): 119-133, ISSN: 2079-3480.

Rodríguez, R., Lores, J., Gutiérrez, D., Ramírez, A., Gómez, S., Elías, A., Aldana, A.I., Moreira, O., Sarduy, L. & Jay, O. 2013. "Inclusion of the microbial additive Vitafert in the in vitro ruminal fermentation of a goat diet". Cuban Journal of Agricultural Science, 47(2): 171-178, ISSN: 2079-3480.

Rodríguez, R., Ontivero, Y., García, Y, Sosa, D. & Gómez, S. 2020. "Empleo del tubérculo de boniato (Ipomoea batatas L.) y la cepa Lactobacillus pentosus LB-31 como aditivos a ensilajes mixtos para rumiantes". Livestock Research for Rural Development, 32, ISSN: 0121-3784, Available: <http://www.lrrd.org/lrrd32/7/rodri32117.htmL>.

Statistical Analysis Systems (SAS). 2013 The SAS System for Windows, Release 9.3. Statistical Analysis Systems Institute, Cary, North Carolina, USA.

Theodorou, M.K., Williams, B., Dhanoa, M., McAllan, A.B. & France, J. 1994. "A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds". Animal Feed Science and Technology, 48(3-4): 185-197, ISSN: 0377-8401, DOI: https://doi.org/10.1016/0377-8401(94)90171-6.

Van Soest, P.J., Robertson, J.B. & Lewis, B.A. 1991. "Methods for Dietary Fiber, Neutral Detergent Fiber, and Nonstarch Polysaccharides in Relation to Animal Nutrition". Journal of Dairy Science, 74(10): 3583-3597, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(91)78551-2.

Recibido: 29 de Abril de 2020; Aprobado: 02 de Junio de 2020

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