Ciencia Animal

Formulación y caracterización de un biopreparado con Lactobacillus plantarum CAM-6, procedente del tracto digestivo de cerdos criollos colombianos

C. A. Betancur¹ 
http://orcid.org/0000-0001-8627-2522

Ana J. Rondón² 
http://orcid.org/0000-0003-3019-1971

Y. Martínez^{3  *} 
http://orcid.org/0000-0003-2167-4904

R. Rodríguez⁴ 
http://orcid.org/0000-0002-6496-4453

¹Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Departamento de Ciencias Pecuarias, Carrera 6 No 76-103, 230002. Montería, Colombia

²Centro de Estudios Biotecnológicos, Universidad de Matanzas, Autopista Varadero km 3 ½. Matanzas, Cuba

³Departamento de Producción Agropecuaria, Escuela Agrícola Panamericana Zamorano. Honduras

⁴Centro de Estudios de Producción Animal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Granma. Granma, Cuba

Resumen

Con el propósito de obtener un biopreparado a partir de un medio de cultivo con extractos acuosos de cáscaras de frutas (banano, piña y papaya) para el crecimiento de Lactobacillus plantarum CAM-6 y la evaluación de sus parámetros cinéticos y estabilidad en el tiempo, se caracterizó la composición físico-química de las cáscaras de las frutas. Luego, se desarrolló un experimento con diseño completamente aleatorizado y cinco tratamientos, en los que se evaluaron diferentes mezclas de agua con proporciones de cáscaras de frutas como medio de cultivo. Se determinó biomasa, concentración de azúcares reductores totales, ácido láctico y pH. Después se desarrolló la cinética de crecimiento en el medio seleccionado durante 24 h y se determinó la velocidad específica de crecimiento y el tiempo de duplicación. Finalmente, se evaluó la viabilidad de la cepa en condiciones de refrigeración, a 4°C, por 48 días. Se demostró que las cáscaras presentan suficientes sólidos solubles (12.50-11.67ºBrix), proteínas (0.33-1.31%) y cenizas (0.53-1.32%) para el crecimiento bacteriano. El medio más adecuado resultó el caldo acuoso de extracto de cáscaras de frutas, que contiene 40 % de cáscaras de frutas y 60 % de agua, con crecimiento de 22.97 LN UFC.mL-1, velocidad de 0.42 h-1 y tiempo de duplicación de 1.12 h. La viabilidad se mantuvo estable durante los primeros 24 días (>22 LN UFC.mL-1) a 4 ºC. Se concluye que el biopreparado con L. plantarum CAM-6 en caldo extracto acuoso de cáscaras de papaya, piña y banano (40:60) garantiza el crecimiento y viabilidad celular durante 24 días.

Palabras clave: cáscaras de frutas; medio de cultivo; cinética de crecimiento; bioprocesos

Las cáscaras de frutas de papaya (Carica papaya L.), piña (Ananas comosus L.) y banano (Musa paradisiaca L.) son residuos constituidos mayoritariamente por agua, hidratos de carbono, fibra, proteínas, lípidos, vitaminas y minerales, que se pueden utilizar como fuente de nutrientes para bacterias, hongos y levaduras. Estas cáscaras proporcionan los elementos necesarios para el crecimiento de diferentes especies de Lactobacillus spp., debido a que su metabolismo es homofermentativo facultativo, ya que utiliza principalmente la glucosa y la fructosa y las convierten en ácido láctico por medio de la vía glucolítica de Embden-Meyerhof-Parnas (^{Jurado-Gámez et al. 2013} y ^{Ravimannan et al. 2014}).

El uso sustentable de estos residuos agrícolas permite reducir la contaminación y consumir lo que usualmente se desecha e incluso generar productos con valor agregado (^{Cervantes et al. 2016}). Las cáscaras de frutas son fuente abundante de azúcares fermentables, que podrían utilizarse en la producción de biomasa microbiana, enzimas (^{Rojas et al. 2018}), biodiesel (^{Patel et al. 2015}) y alimentos para los animales (^{Ospina et al. 2012}, ^{Tijani et al. 2012} y ^{Saheed et al. 2013}). En la actualidad, la mayoría de los países en vías de desarrollo o económicamente avanzados enfrentan el problema de la disposición y el tratamiento de estos residuos, cuya reutilización podría reducir su volumen, con beneficios técnicos, económicos y ambientales (^{Ali et al. 2014} y ^{Hamzah et al. 2018}).

En Colombia se generan grandes concentraciones de desechos sólidos (cáscara y bagazo), producto de la obtención de jugos y conservas, principalmente de papaya, piña y banano, que son las frutas más aceptadas y de elevada producción en el país. Estos residuos se podrían aprovechar en la elaboración de productos de alto valor biológico, como son los probióticos, lo que contribuiría a eliminar una fuente de contaminación importante (^{Gowe 2015}, ^{DNP 2016} y ^{Anbu et al. 2017}).

Generalmente, las bacterias ácido lácticas (BAL) se cultivan en medios enriquecidos con nutrientes específicos como el MRS (^{de Mann et al. 1960}), que resultan muy costosos y a escala de laboratorio se requieren en grandes volúmenes. Ante estos requerimientos, se hace necesaria la búsqueda de otras alternativas para cultivar lactobacilos probióticos en medios con componentes nacionales y de alta disponibilidad.

El objetivo de este trabajo fue obtener un biopreparado a partir de un medio de cultivo con extractos acuosos de frutas (banano, piña y papaya) para el crecimiento de Lactobacillus plantarum CAM-6 y para la evaluación de sus parámetros cinéticos y estabilidad en el tiempo.

Materiales y Métodos

Análisis físicoquímico de las cáscaras de frutas. Se tomaron aleatoriamente tres muestras de cada una de las cáscaras (papaya, banano y piña) que se trituraron en un mortero. Se determinó el contenido de azúcares totales, ºBrix, mediante un refractómetro portátil (Toledo Refracto 30P, España). Se analizó, además, el pH (pH metro, OAKLON®, España), la humedad, proteínas, cenizas y acidez (expresada en % ácido málico y ácido cítrico), según los métodos de la ^{AOAC (1997)}.

Cepa empleada. Para establecer el medio de cultivo destinado al crecimiento de L. plantarum CAM-6, se utilizó la cepa Lactobacillus plantarum CAM-6 (número de accesión al GenBank: MK523644), que proviene del contenido del recto de cerdos zungos pelados. Esta cepa se halla depositada en el cepario del Laboratorio de Biotecnología de la Universidad de Córdoba, Colombia.

Tratamiento de los residuos agroindustriales. Las cáscaras de papaya, banano y piña, procedentes de la planta procesadora para la elaboración artesanal de ensalada de frutas del mercado de Montería, Córdoba, Colombia, se trasladaron a las instalaciones del Laboratorio de Fermentaciones y Bioprocesos de la Universidad de Córdoba, para la obtención del caldo extracto acuoso de cáscaras de frutas (CEACF). Las cáscaras se lavaron y mezclaron en una proporción 1:1:1. Luego, se trituraron en agua potable según el diseño en una licuadora industrial (Fitmix, Alemania). Posteriormente, el extracto acuoso se filtró tres veces. La primera filtración se realizó mediante un colador, la segunda con gasa y la tercera con papel de filtro.

Diseño del medio de cultivo. Para el diseño del medio de cultivo, se realizó un experimento completamente aleatorizado con la disposición de cinco tratamientos y tres repeticiones: CEACF-1: 70 % de agua potable y 30 % de cáscaras de frutas, CEACF-2: 60 % de agua potable y 40 % de cáscaras de frutas, CEACF-3: 50 % de agua potable y 50 % de cáscaras de frutas, CEACF-4: 40 % de agua y 60 % de cáscaras de frutas y CEACF-5: 30 % de agua y 70 % de cáscaras de frutas. Por cada tratamiento se adicionaron 100 mL del extracto obtenido en Erlenmeyers de 250 mL de capacidad, los que se ajustaron a pH 5.6 ± 0.2 (pHmetro HANNA, EE.UU.), con citrato de calcio o ácido cítrico, a concentración de 99 y 96 % de pureza, respectivamente. Luego, se esterilizaron a 121 °C durante 15 min. en una autoclave (Systec VB-55, Alemania).

La cepa Lactobacillus plantarum CAM-6, cultivada en caldo MRS durante 18 h, a 37 ºC (1010 UFC.mL-1), se inoculó al 10 % (v/v) en cada uno de los Erlenmeyers. Posteriormente, se colocó un tapón y se adaptó una venoclisis como sistema para la extracción de muestras. La fermentación se realizó a temperatura ambiente (30 ± 2°C), con agitación constante a 100 r.p.m. en un agitador orbital (SK-o330-Pro LB PRO, EE.UU.) durante 24 h.

Indicadores evaluados. En las muestras de 24 h se cuantificó el crecimiento de L. plantarum CAM-6 mediante el peso seco (^{Harrigan y McCance 1968}) y se determinó, además, la concentración de azúcares reductores totales (ART) de acuerdo con la técnica de ^{Miller (1959)} y el ácido láctico (^{AOAC 1997}). El pH se calculó con un potenciómetro digital (Metrohm 744, Suiza).

Diseño e indicadores evaluados. La cinética de crecimiento de Lactobacillus plantarum CAM-6 se evaluó en un experimento con diseño completamente aleatorizado. Para ello se inoculó la cepa en caldo MRS y se incubó a 30 ºC durante 18 h. Este inóculo se sembró al 10 % (v/v) en 27 Erlenmeyers que contenían el medio seleccionado anteriormente (CEACF-4). Los Erlenmeyers se mantuvieron en incubación durante 24 h a 30 ºC. Cada tres horas se tomaron tres repeticiones para determinar el conteo de viables mediante el método de las diluciones seriadas en agua de peptona (1%, p/v). Para el conteo de las colonias (^{Harrigan y McCance 1968}), se procedió a la siembra en placas con agar MRS durante 48 h, a 30 ºC. Como medio de referencia se utilizó el caldo MRS, donde se cultivó la cepa en las mismas condiciones. A partir del programa Microsoft Excel y los datos obtenidos de la cinética de crecimiento, se confeccionaron las curvas de dispersión. Mediante la aplicación del método de ajuste se obtuvieron los polinomios correspondientes y los valores de la velocidad específica de crecimiento (µ). El tiempo de duplicación (td) se determinó mediante la fórmula td = LN 2/µ (^{Madigan et al. 1997}).

Los azúcares reductores se cuantificaron por el método de dinitrosalisílico (DNS), según ^{Miller (1959)}. La acidez, expresada en ácido láctico, se calculó mediante la acidez titulable, según ^{AOAC (1997)}. El pH en cada muestreo se midió con pHmetro digital (Sartorius Meter PP-25, Göttingen, Alemania).

Diseño del experimento y conteo de células viables. Para el desarrollo de este ensayo se obtuvo el inóculo a partir del cultivo de la cepa CAM-6 en caldo MRS durante 18 h, a 37 ºC, en condiciones estáticas. Se sembró al 10 % (v/v) en tres Erlenmeyers de 5 L de capacidad, con cuatro litros del medio seleccionado y pH 5. Los Erlenmeyer se mantuvieron a 37 ºC durante 24 h. Posteriormente, se realizó un ensayo en el que se aplicó un diseño completamente aleatorizado, al distribuir el contenido de cada Erlenmeyer en 35 frascos de cristal estériles, de 50 mL de volumen efectivo y tapa de goma. Las muestras se mantuvieron en refrigeración (4 ºC) hasta los 48 d. En cada muestreo (cada ocho días) se tomaron cinco frascos, de los cuales se extrajo 1 mL. Mediante diluciones seriadas en agua de peptona (1%, p/v) se sembraron (10-7- 10-9) en placas con agar MRS. Después de la incubación a 37 ºC durante 48 h se realizó el conteo de las UFC.

Procesamiento estadístico. En el análisis físico-químico de las cáscaras de frutas, los datos se procesaron mediante estadística descriptiva (desviación estándar y coeficiente de variación). Para la determinación de la mejor variante de CEACF y los estudios de viabilidad de Lactobacillus plantarum CAM-6 en el tiempo, se realizaron análisis de varianza de clasificación simple (ANOVA), con previa determinación de la normalidad, homogeneidad de los datos y con un nivel de significación de P < 0.05. La prueba de ^{Duncan (1955)} se usó para la comparación múltiple entre las medias mediante el paquete estadístico SPSS, versión 21.0 (^{Pardo y Ruíz 2002}). Los resultados de la cinética de crecimiento se procesaron mediante el programa Excel 2016, con el cual se ejecutó el modelo de ^{Monod (1949)}. Los conteos de microorganismos viables se transformaron a LN para garantizar las condiciones de normalidad.

Resultados y Discusión

En la tabla 1 se muestran los resultados de la composición química de las cáscaras de papaya, banano y piña. Estos valores se corresponden con lo informado en la literatura. La ^{FAO (2007)} refiere que la papaya posee, aproximadamente, 13 % de azúcares, 85 % de humedad y 0,6 % de proteínas. Señala que la piña contiene de 12 a 15 % de azúcares, de 80 a 85 % de agua y 0.58 % de proteína. Para el banano informa 79.2 % de humedad, 0.83 % de proteínas y 12 % de azúcares.

Tabla 1 Composición química de las cáscaras de papaya, banano y piña, procedentes de la planta procesadora de frutas del mercado de Montería, Córdoba, Colombia (n=3). 

Indicadores	Cáscara de papaya	DE	CV, %	Cáscara de banano	DE	CV, %	Cáscara de piña	DE	CV, %
Sólidos solubles, ºBrix	11.67	0.251	2.14	11.67	0.208	1.78	12.50	0.264	2.11
pH	6.42	0.059	0.91	5.85	0.005	0.08	4.91	0.551	11.22
Acidez*, %	0.18	0.018	10.00	0.31	0.038	12.25	0.47	0.036	7.65
Humedad, %	87.59	0.722	0.82	88.06	0.114	0.13	82.24	1.18	1.43
Proteína bruta, %	1.31	0.007	0.53	0.33	0.009	2.72	1.14	0.086	7.54
Cenizas, %	0.55	0.039	7.09	1.23	0.068	5.52	0.89	0.075	8.42

*Acidez se expresa según el ácido abundante: ácido málico en papaya y banano y ácido cítrico en piña. Los datos de la composición química se expresan en base húmeda.

DE: Desviación estándar

CV: Coeficiente de variación

Con respecto a los sólidos solubles, expresados en grados Brix, se refieren valores entre 11.6 y 12.5 en las cáscaras de frutas, niveles que se consideran admitidos según lo establecido como el mínimo aceptable para los cultivadores comerciales (^{Zhou et al. 2000}). El pH bajo se debe al aporte de ácidos, según el tipo de fruta. La alta humedad está dada por el elevado contenido de agua de estos residuos (^{Hamzah et al. 2018}).

Aun cuando el nivel de proteína que presentan las diferentes cáscaras de frutas ensayadas es bajo, el contenido es suficiente para el crecimiento de las bacterias. Las proteínas forman parte de la estructura de las células microbianas y son necesarias para el crecimiento de los microorganismos (^{Prescott et al. 2004}). Como se sabe, en la industria de las fermentaciones se utilizan fuentes inorgánicas de nitrógeno, las cuales tienden a ser costosas en los medios de cultivo, lo que las convierte en una limitante para la elaboración de productos orgánicos obtenidos por fermentación (^{Serna y Torres 2015}).

El valor de las cenizas, obtenido en las cáscaras de banano (1.23 %) demuestra su alto contenido de minerales (Ca, K y Mg). La composición mineral de los residuos contribuirá al desarrollo de algunas reacciones metabólicas de las bacterias en el medio de cultivo formulado (^{Anbu et al. 2017} y ^{Saleem y Saeed 2019}).

Estudios realizados por ^{De Oliveira et al. (2015)} y ^{Vargas et al. (2019)} confirman que las cáscaras de los frutos tienen mayor concentración de elementos minerales, azúcares totales y proteína bruta que la pulpa, lo que indica que esos residuos poseen gran potencial de uso como materia prima para la elaboración de alimentos para animales. Estos autores refieren que, por el contenido de cenizas en las cáscaras, se consideran fuentes potenciales de minerales. La composición de cenizas varía de acuerdo con el fruto, estado de madurez, variedad y temporada de cosecha, así como por las condiciones de cultivo (^{Priego 2007}).

La utilización de residuos agroindustriales como materia prima de bajo costo representa una opción para transformar los desechos en compuestos con propiedades benéficas (^{Carota et al. 2016}, ^{Yoong et al. 2017} y ^{Vargas et al. 2019}). Se comprobó que las cáscaras de frutas contienen carbohidratos, proteínas, vitaminas y minerales, que podrían satisfacer las necesidades nutricionales de Lactobacillus plantarum CAM-6.

La tabla 2 muestra los resultados del crecimiento de Lactobacillus plantarum CAM-6 en cada uno de los tratamientos evaluados para la obtención del medio de cultivo CEACF. Se comprobó que la mayor (P < 0.05) producción de biomasa, ácido láctico y ART se presentó en los medios CEACF-4 y CEACF-5. También se pudo ver que los menores valores de pH se encontraron en las dos últimas variantes. Estos resultados demuestran que Lactobacillus plantarum CAM-6 es capaz de producir ácidos que disminuyen el pH en estos medios. Las bacterias probióticas, especialmente los lactobacilos, transforman las fuentes de carbono en ácidos orgánicos que intervienen en la inhibición de microorganismos patógenos y en la solubilización de minerales, además de contribuir al mantenimiento de la integralidad de la mucosa intestinal (^{Vera et al. 2018}).

Tabla 2 Características del cultivo de L. plantarum CAM-6 en diferentes variantes de CEACF de papaya, banano y piña a las 24 h, a 30 ºC. 

Indicadores	CEACF-1	CEACF-2	CEACF-3	CEACF-4	CEACF-5	EE±	P
Biomasa, g	25.49b	34.37b	44.16ab	55.18a	60.46a	2.977	0.003
pH	5.83a	5.57a	5.28a	4.72b	4.68b	0.066	0.014
Ácido láctico, g.L-1	3.49b	5.41b	5.57b	7.01a	7.11a	0.262	0.001
ART, g.L-1	21.12c	33.27b	44.04a	48.00a	47.00a	0.803	0.001

a,b,c Medias con letras diferentes en la misma fila difieren para P < 0.05 (^{Duncan 1955}).

ART: Azúcares reductores totales

Las cáscaras de frutas constituyen un potencial de materia prima para la producción de biopreparados como vehículos para la administración de probióticos, debido a su alto contenido de carbohidratos (^{Vargas et al. 2019}). La concentración de ART fue mayor en las variantes CEACF-3, CEACF-4 y CEACF-5, lo que indica que después de 24 h de fermentación, estos medios todavía contienen fuentes de carbono utilizables por estas bacterias. Específicamente, las variantes CEACF-4 y CEACF-5 presentaron alta producción de biomasa, ácido láctico y valores de pH menores, lo que podría contribuir a su conservación en el tiempo. Por otra parte, si se aplica el aditivo completo (células + ácido), estos últimos (ácidos) contribuirán a ejercer mayor acción en los animales. Se optó por el CEACF-4, ya que este medio posee en su composición menor porcentaje de cáscaras de frutas, lo que representa ahorro de materia prima.

En la figura 1A se muestran los resultados de la cinética de crecimiento de Lactobacillus plantarum CAM-6 en los medios CEACF-4 y MRS durante 24 h. Se muestra que no existen diferencias en el conteo de las UFC en las horas de muestreo, cuando se emplean ambos sustratos (P ˃ 0.05). En cada caso, la población inicial comenzó su crecimiento desde las primeras horas, y una vez en la fase exponencial, las células se reproducen sin limitación de sustancias nutritivas a velocidad máxima. En la figura 1B se muestra que a mayor producción de ácido láctico disminuyó la concentración de ART y el pH en el medio CEACF-4. Se conoce que las BAL utilizan carbohidratos fermentables como fuente de energía para formar ácido láctico principalmente (^{Zamudio y Zavaleta 2003}).

Figura 1A y 1B 1A: Comportamiento de la cinética de crecimiento de Lactobacillus plantarum CAM-6 en los medios de cultivo CEACF-4 y MRS; 1B: Producción de ácido láctico, concentración de ART y pH durante 24 h. Las barras representan la desviación estándar. 

El medio CEACF-4 resultó adecuado para el crecimiento de Lactobacillus plantarum CAM-6 (tabla 3). Al comparar el crecimiento de la cepa en este medio con respecto al MRS, no se observaron diferencias.

Tabla 3 Crecimiento de L. plantarum CAM-6 en los medios MRS y CEACF-4 a 30 ºC. 

Cepa	Medio	LN UFC.mL-1 24 h	EE ±	P	µ (h-1)	td, h	R2
Lactobacillus plantarum CAM-6	MRS	21.97 (3.5X109)	0.572	0.281	0.46 ±0.83	1.05±0.83	0.9977
	CEACF-4	22.97 (9.5X109)			0.42±0.86	1.12±0.86	0.9981

1El crecimiento de las cepas bacterianas se expresa en LN.

( ) Datos originales.

µ: Velocidad específica de crecimiento,

td: tiempo de duplicación

R2: Coeficiente de determinación.

Los resultados indican que los componentes del CEACF-4 suplen los requerimientos nutricionales de estos microorganismos de forma similar al medio de referencia, por lo que podría ser utilizado como medio de cultivo para la elaboración de probióticos. Para el medio CEACF-4, se obtuvo una tasa específica de crecimiento de 0.42 ± 0.86 h-1 y un tiempo de duplicación de 1.12 ± 0.86 h, con ajuste de los datos R2 = 0.9981. Estos valores se hallan muy cercanos a los valores obtenidos por ^{Aguirre et al. (2010)}.

^{Garriga et al. (1998)} refieren que cuando se evalúan las potencialidades de las cepas candidatas a probióticas se debe comprobar que presenten alta velocidad de crecimiento y tiempo de duplicación igual o aproximado a una hora. De esta manera, los microorganismos que se utilicen tendrán mayores posibilidades de ser duplicados rápidamente en el tracto gastrointestinal para lograr su predominio en este ecosistema. Esto se demostró en este trabajo, donde se pudo comprobar que la cepa Lactobacillus plantarum CAM-6 presenta dichas características.

En la figura 2 se representa la dinámica del comportamiento de la viabilidad de Lactobacillus plantarum CAM-6 cultivada en el CEACF-4, desde el día primero hasta los 48 d de muestreo. Hasta los 24 d, el biopreparado mostró estabilidad en el conteo en condiciones de refrigeración (>21 LN UFC.mL-1). Es precisamente después de ese tiempo, cuando se evidencia la disminución de las células viables en el biopreparado, aunque la población de células que contiene a los 48 d (19 LN UFC.mL-1) es suficiente para desarrollar actividad probiótica (> 108 UFC.mL-1). ^{Jin et al. (1998)} definieron que los biopreparados probióticos ejercerán su efecto, si contienen 109 UFC.mL-1.

a,b,c,d Letras diferentes difieren para P < 0.05 (^{Duncan 1955})

(P < 0.001)

EE ± 0.094

Figura 2 Dinámica de la viabilidad de Lactobacillus plantarum CAM-6 en el biopreparado en condiciones de refrigeración, a 4 ºC. 

Se concluye que el biopreparado con L. plantarum CAM-6 en caldo extracto acuoso de cáscaras de papaya, piña y banano (40:60) posee los nutrientes necesarios que garantizan una alta población de células, con mayor velocidad de crecimiento y tiempo de duplicación. Además, se observó viabilidad celular durante 24 d, en condiciones de refrigeración, a 4°C.

Agradecimientos

Se agradece a los especialistas del Laboratorio de Ingeniería de Alimentos de la Universidad de Córdoba.

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Recibido: 31 de Enero de 2020; Aprobado: 16 de Junio de 2020