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INTRODUCCIÓN
Los productos avanzados de la glicosilación de proteínas constituyen mediadores importantes que ocasionan daño al tejido renal en diferentes situaciones clínicas como: La Insuficiencia Renal Aguda y crónica, la Nefropatía Diabética, la Glomerulonefritis, entre otras (Arsov et al., 2014). Estos productos avanzados de la glicosilación de proteínas (PAGP) aparecen en condiciones fisiopatológicas (Diabetes Mellitus e Insuficiencia Renal), donde la interacción química de la glucosa con la proteína es excesiva sin intervención enzimática (Ansari & Dash, 2013; Ott et al., 2014), produciendo la glicosilación de las proteínas (albumina). El producto inicial de la glicosilación de las proteínas es la base de Schiff, que se caracteriza por un reordenamiento intramolecular lento transformándose en fructosamina, tal como se le dominó a los PAGP. Este compuesto juega un papel crucial en el deterioro de la estructura y función renal en pacientes portadores de Nefropatía Diabética (Cruz & Licea, 2010; Fotheringham et al., 2022).
Se han encontrado receptores de PAGP en numerosas células, como macrófagos, monocitos, células endoteliales, linfocitos, células mesangiales, podocitos, capaces de unirse a estos (Egaña et al., 2020). La unión de los PAGP a los receptores en el macrófago, causa la activación de estos y se comienza a liberar citocinas proinflamatorias como la interleucina 1 (IL-1), el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), interleucina 8 (IL-8), interleucina 6 (IL-6) y el factor estimulador de colonia de granulocitos y monocitos (FSC-GM), capaces de dañar diferentes órganos como los riñones (Cruz & Licea, 2010; Egaña et al., 2020). En particular, se reporta que cuando se unen los PAGP a los receptores de las células mesangiales del glomérulo, estas producen cantidades crecientes de factor de crecimiento plaquetario (FCP) el cual promueve la producción de colágeno tipo IV, laminina y proteoglicano, causando expansión mesangial, glomérulo esclerosis focal y proteinuria (Cruz & Licea, 2010; Egaña et al., 2020). A nivel renal, tanto en el daño agudo (isquemia-reperfusión renal y necrosis tubular aguda) como en el daño crónico (glomérulonefritis crónica e insuficiencia renal crónica), los PAGP causan el incremento de los niveles de Endotelina-1, potente vasocontrictor, que disminuye el coeficiente de filtración glomerular (kf), reduciendo la intensidad de filtración glomerular y empeorándose de esta manera la función renal (Cruz & Licea, 2010; Fotheringham et al., 2022). Adicionalmente, se demostró que los PAGP son capaces de reaccionar con el óxido nítrico (ON), inactivarlo y disminuir así, la respuesta vasodilatadora en arterias renales de pacientes portadores de nefropatía diabética (Cruz & Licea, 2010; Fotheringham et al., 2022).
Otro mediador del daño renal es la enzima fosfolipasa A2 (FLA2), esta enzima es una ATPasa, que hidroliza los enlaces éster presentes en los fosfolípidos (Ratee et al., 2009; van Hensbergen et al., 2020), que interviene en el metabolismo del ácido araquidónico. En el tejido renal inflamado por proceso de isquemia-reperfusión renal, glomérulonefritis e insuficiencia renal, se estimula la reacción catalizada por FLA2 donde es liberado el ácido araquidónico de los fosfolípidos de las membranas celulares. Esto provoca alteración en la composición y propiedades funcionales de la bicapa lipídica de las membranas plasmáticas y a nivel de los organelos membranosos intracelulares (mitocondrias, etc) (Ratee et al., 2009; van Hensbergen et al., 2020). A consecuencia del incremento de la actividad de la FLA2 en el tejido renal lesionado, se liberan cantidades crecientes de ácidos grasos tóxicos capaces de desacoplar la fosforilación oxidativa provocando un daño en la síntesis de ATP a nivel de células renales (Hu et al., 2019; Portilla et al., 1994; Ozaki et al., 1999).
La ozonoterapia posee acciones biológicas generales, que incluyen: la estimulación del metabolismo del oxígeno, el mejoramiento de las propiedades reológicas de la sangre, la liberación de prostaciclinas, la estimulación de los sistemas antioxidantes endógenos y el efecto inmunomodulador (Menéndez et al., 2008), que particularmente en modelos de daño renal agudo y crónico (Hui et al., 2008; Borrego et al., 2004) mejoraron la función y estructura del riñón. Por lo que el objetivo del estudio es evaluar la influencia de la OTR sobre niveles tisulares de fructosamina como PAGP y actividad de la fosfolipasa A2 como mediadores en el daño renal crónico, inducido por ablación de la masa renal.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Animales:
Se utilizaron en el estudio, 40 ratas Wistar hembras de 200-220 gramos de peso corporal, procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Todos los procedimientos fueron realizados según lo aprobado por los Comités Éticos Internacionales para el Cuidado de los Animales, de acuerdo con las regulaciones ya establecidas para la experimentación animal (ICILAS 2000).
Diseño experimental
Se crearon 4 grupos de 10 animales cada uno, distribuidos de la siguiente manera.
Grupo 1. Grupo control sin daño renal.
Grupo 2. Grupo con daño renal por ablación de la masa renal (AMR) sin tratamiento.
Grupo 3. Grupo con daño renal por AMR, tratado con oxígeno por vía rectal.
Grupo 4. Grupo con daño renal por AMR, tratado con ozonoterapia rectal (OTR).
Insuficiencia Renal Crónica (IRC) por ablación de la masa renal (AMR)
Los animales anestesiados con pentobarbital sódico (30 mg/kg, vía ip), se les realizó la laparotomía ventral, el riñón derecho fue removido (nefrectomía derecha), previa ligadura del paquete vascular renal, mientras que dos tercios del riñón izquierdo sufrió infarto agudo, inducido por ligadura de dos ramas principales de la arteria renal izquierda. De esta forma se obtuvo una IRC por ablación de 5/6 de la masa renal (Calunga et al., 2005). Culminado el procedimiento quirúrgico, se suturó la incisión abdominal. Transcurridas 10 semanas, se comenzaron a aplicar los tratamientos de ozonoterapia y oxígeno por vía rectal.
Tratamiento con ozono
La ozonoterapia se aplicó, utilizando un generador de ozono (Ozomed ( plus) fabricado en el Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC), La Habana, Cuba. La mezcla ozono/oxigeno (MOO), generada por el equipo, se administró por vía rectal utilizando una jeringa conectada a una sonda de polietileno. Se aplicó un volumen de 2.5-2.6 mL, con una concentración de la MOO de 50 µg/ml, cada 24 h, durante 10 días, para una dosis de 0.5 mg/kg de peso. El grupo de animales que recibió oxigeno por vía rectal, se le aplicó igual volumen, equivalente a 26 mg/kg, durante 10 días consecutivos, con igual frecuencia.
Obtención de las muestras de riñón
La eutanasia de los animales, se practicó, culminados los 10 días de tratamiento, mediante sobredosis de anestesia, con Tiopental sódico (50 mg/kg). Se extrajeron los riñones y se conservaron a -20 ( C.
Preparación de homogenado de tejido renal
El tejido renal, se homogenizo en un destructor de tejido Edmound Bohler HO4 (Alemania). Se Homogenizó una porción de tejido previamente pesado, se le adicionaron 5 mL de solución amortiguadora KCI-histidina, y posteriormente, se centrifugó a 5 000 rpm/min, durante 15 min a 4 ° C para la obtención del sobrenadante, el cual se conservó a -20 °C hasta el momento de realizar las determinaciones de la actividad de la fosfolipasa A2 (FLA2) y la fructosamina como indicador de los productos avanzados de la glicosilación de las proteínas (PAGP).
Variables
La actividad total renal de FLA2 se determinó por el procedimiento descrito por Hotter et al., 1991. Los niveles renales de fructosamina, como indicador de PAGP, se determinó por método fotocolorimétrico, expresándose en unidades de densidad óptica por gramo de tejido renal, método descrito por Thome et al., 1996.
Análisis Estadístico.
Primeramente, se realizó el análisis descriptivo en el cual se calcularon la media y desviación estándar para cada grupo y variables. Se realizaron comparaciones simples entre grupos, para las variables actividad de enzimas FLA2 y los niveles de fructosamina, utilizando el ensayo no paramétrico de U de Mann-Whitney. El nivel de significación estadística empleado en todos los casos fue p<0.05
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
La insuficiencia renal crónica inducida por AMR, produjo un incremento significativo de la actividad de la FLA2 y los niveles de fructosamina con respecto al grupo control sano (Tabla 1). El grupo de animales tratados con ozonoterapia rectal, experimentó una reducción de los niveles de fructosamina y actividad de la FLA2, con respecto al control dañado, sin que este última alcanzara niveles similares a los del control sano. Las aplicaciones de oxígeno, no mostraron diferencias significativas (p<0,05) con respecto al grupo control dañado.
Tabla 1 Influencia de la ozonoterapia rectal sobre la actividad de la FLA2 y los niveles de Fructosamina en tejido renal de ratas con IRC por AMR.
La insuficiencia renal crónica inducida por ablación de la masa renal (IRC-AMR), incrementó significativamente la actividad de la FLA2 y los niveles de fructosamina en el tejido renal, como productos avanzados de la glicosilación de proteínas (PAGP), con respecto al grupo control aparentemente sano. La ozonoterapia rectal (10 aplicaciones), revirtió la disfunción renal, mediante la reducción de la actividad de las FLA2 y los niveles de fructosanima en el tejido renal de ratas con IRC-AMR.
Por primera vez, se demostró que el efecto protector renal de la ozonoterapia, en parte, es mediada por la reducción de la formación de PAGP y la actividad de la FLA2, en el modelo de IRC -AMR. Resultados, similares se alcanzaron en modelos de daño renal agudo, (Calunga et al., 2009; Calunga et al., 2019) confirmando así, que la ozonoterapia rectal es capaz de reducir el daño renal y preservar la función de este, tanto en procesos agudos como crónicos. Dicho mecanismo, se encuentra, adicionalmente, favorecido por la acción estimuladora de enzimas antioxidantes endógenas, tal como se ha evidenciado en estos y otros modelos experimentales en los que se evaluó la ozonoterapia (Barber et al., 1999; Hotter et al., 1991; Calunga et al., 2009. La actividad de la catalasa (CAT) y la superóxido dismutasa (SOD), acompañado por la reducción de los niveles de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (SRATB), fue el mecanismo responsable de la disminución del daño crónico renal, definido por el restablecimiento del flujo plasmático renal, la intensidad del filtrado glomerular, los niveles de creatinina y las proteínas excretadas (Barber et al., 1999; Hotter et al., 1991; Calunga et al., 2009; Calunga et al., 2019)
Los PAGP tienen un importante papel dentro del proceso fisiopatológico del daño renal crónico. Cuando los PAGP, se unen a sus receptores, ocurre una rápida disminución de la trombomodulina, impidiendo la activación de la proteína C (agente anticoagulante capital). Este hecho, durante un proceso de isquemia-reperfusión, promueve la formación de trombos en arterias renales disminuyendo la I.F.G. (Stirban, Gawlowski, Roden. 2014; Cohen, 2011).
Anteriormente, se reportó la vinculación del efecto protector de la ozonoterapia mediado por la reducción de los niveles de la fructosamina y PAGP, así como la actividad de la FLA2, en modelo crónico experimental de GTEA, (Calunga et al., 2010) resultados que se corresponden con los reportados en el modelo de IRC-AMR de este estudio (Tablas 1). Adicionalmente, la modulación del estado Redox intracelular, que conduce al mejoramiento de la función renal y reversión del daño histomorfológico del tejido, tanto en el modelo de GTEA (Calunga et al., 2010) y IRC-AMR (Calunga et al., 2019), son aspectos bioquímicos-estructurales favorecidos por la ozonoterapia rectal.
En el modelo de I/R renal, se evidencia histomorfologicamente que la ozonoterapia revierte del daño provocado, que en primer lugar puede estar sustentado por la disminución en los niveles de fructosamina a nivel renal, (Thome et al., 1996) lo que impediría la formación de trombos, mejorando así, la función del riñón (niveles del flujo plasmático renal (FPR) e Índice de filtrado glomerular (IFG)). Además, los PAGP tras unirse a sus receptores activan al factor transcripcional NF-KB este promueve la expresión de interleucinas proinflamatorias, creándose un estado pro-inflamatorio el cual daña severamente la función y estructura de la nefrona (Cohen, 2011; Radcliffe et al., 2017). Por otra parte, los PAGP producen reducción del ON e incrementan los niveles renales de endotelina-1, provocando así, la disminución del coeficiente de filtración glomerular (kf) y el IFG (Cohen, 2011; Radcliffe et al., 2017). Adicionalmente, los PAGP al unirse a sus receptores en las células mesangiales y podocitos producen proteinuria (Fotheringham et al., 2022; Cohen, 2011; Radcliffe et al., 2017). Por lo que la reducción de los PAGP, por parte de la ozonoterapia rectal, conduce a la disminución de la activación de los receptores, por tanto, se espera un menor daño inflamatorio renal, poco deterioro de la función del riñón, disminución de niveles plasmáticos patológicos de creatinina, reducción del grado de proteinuria y preservación en gran medida de la arquitectura renal, tanto en biomodelos agudos como crónicos.
Por otra parte, también los PAGP son capaces de inducir mecanismos productores de especies reactivas del oxígeno (ERO), fundamentalmente, peróxido de hidrógeno y el anión superóxido, provocando un estrés oxidativo a nivel renal, el que contribuye al deterioro de la función de la nefrona ((Hotter et al., 1991; Diaz & Luna, 2016; Calunga et al., 2019; Radcliffe et al., 2017; Delgado et al., 2017). La ozonoterapia, por la vía de la activación del factor transcripcional nuclear eritroide 2 (Nrf2), estimula endógenamente la síntesis de enzimas antioxidantes como la SOD y la CAT, controlando el estrés oxidativo (Delgado et al., 2017; Galie et al., 2019; Martinez at al., 2012). Por tanto, se sugiere, que la ozonoterapia no solo tiene acción nefroprotectora, sino citoprotectora, justificada por el poder de estimular la síntesis endógena de enzimas antioxidantes (CAT y la SOD), la reducción en los niveles de peroxidación lipídica y por ende el daño oxidativo desarrollado en diferentes condiciones fisiopatológicas (Hui et al., 2008; Al-Dalain et al., 2001; Bocci, 2006; Borrego et al., 2004; Calunga et al., 2004; Calunga et al., 2019).
El proceso inflamatorio renal tanto agudo como crónico, se ha vinculado al incremento de la expresión de citocinas proinflamatorias, a través de la estimulación del factor de transcripción nuclear NF-kB (Xing et al., 2015). Dichos autores, demostraron que la ozonoterapia redujo el daño renal, mediante la disminución de la expresión tisular de este factor y consecuentemente redujo la expresión de citocinas proinflamatorias (FNT, la IL1 y la IL-6) y estos resultados, se corresponden con los demostrado por Calunga et al., 2019, quienes confirman que la OTR redujo la expresión de la IL-6, acompañada por el incremento de la actividad de los sistemas antioxidantes endógenos en el modelo de IRC por AMR.
Otro de los mecanismos moleculares que revelan y sustentan el indiscutible efecto nefroprotector de la ozonoterapia, es su influencia sobre la disminución de la expresión del NLRP3 (inflamosoma), la caspasa 1-p-10, conjuntamente con la IL-1 β en ratas con 5/6 nefrectomizados (Yu et al., 2017).
La actividad de FLA2 fue menor significativamente por la ozonoterapia rectal en el modelo de daño renal crónico (IRC-AMR), reflejando así el efecto antinflamatorio. Esto ha sido demostrado, en otros modelos experimentales, como el de alcoholismo (Adali et al., 2019), de displasia en ratones transgénicos ((Peirone et al., 2018) y daño pulmonar por I/R (Wang et al., 2018), preservando así la integridad de las estructuras tisulares. Estos resultados, sustentan que el uso de inhibidores de FLA2, tiene efecto protector en el daño isquémico cardiaco, en cultivos de células renales y del túbulo proximal (Hotter et al., 1991).
Estos resultados, sustentan los efectos beneficiosos de la ozonoterapia rectal por AMR, compartiendo mecanismos de acción en común, como es, la estimulación del sistema antioxidante endógeno, modular la respuesta inflamatoria, mediante la reducción de los PAGP y la actividad de la FLA2, acciones fundamentales que aseguran la preservación de la función renal y la reversión del daño estructural histopatológico evidenciado en los modelos de daño renal estudiados hasta el momento.
CONCLUSIONES
La Ozonoterapia rectal demostró acción antinflamatoria, mediante la reducción de los niveles de fructosamina y la actividad de FLA2 a nivel renal, como mecanismo contribuyente a la preservación de la estructura y función del riñón sometido a daño renal experimental crónico, por ablación de la masa renal.
